Secuencia de estudio del genoma

Las secuencias de análisis genómico de lectura única aleatoria (GSS) se generan mediante selección aleatoria. La secuenciación de lectura única, con menor fidelidad, puede utilizarse para la acumulación rápida de datos genómicos, pero con menor precisión. ^{[ 7 ]} Incluye RAPD , RFLP , AFLP , etc. ^{[ 8 ]}

Las secuencias terminales de Cosmid/BAC/YAC utilizan cromosomas artificiales bacterianos / de levadura para secuenciar el genoma desde el extremo. Estas secuencias actúan como plásmidos de muy baja copia, a veces con solo una copia por célula. Para obtener suficientes cromosomas, se necesita un gran volumen de cultivo de E. coli; entre 2,5 y 5 litros puede ser una cantidad razonable. ^{[ 9 ]}

Los cósmidos/BAC/YAC también pueden utilizarse para obtener clones de fragmentos de ADN más grandes que los que se obtienen con vectores como plásmidos y fagemidos. Un inserto más grande suele ser útil para el proyecto de secuenciación a la hora de organizar los clones. ^{[ 10 ]}

Las proteínas eucariotas pueden expresarse utilizando YAC con modificación postraduccional. ^{[ 11 ]} Los BAC no pueden hacer eso, pero los BAC pueden representar el ADN humano de manera mucho más fiable que los YAC o los cósmidos. ^{[ 12 ]}

La secuencia atrapada de exones se utiliza para identificar genes en ADN clonado, y esto se logra reconociendo y atrapando la secuencia portadora que contiene el exón del ADN. El atrapamiento de exones tiene dos características principales: Primero, es independiente de la disponibilidad del ARN que expresa el ADN objetivo. Segundo, las secuencias aisladas se pueden derivar directamente del clon sin conocer los tejidos que expresan el gen que se necesita identificar. ^{[ 13 ]} Durante el corte, el exón puede permanecer en el ARNm y la información que contiene el exón puede estar contenida en la proteína. Dado que se puede insertar un fragmento de ADN en secuencias, si un exón se inserta en un intrón , el transcrito será más largo de lo habitual y este transcrito puede atraparse mediante análisis.

El elemento repetitivo Alu pertenece a los elementos intercalados cortos (SINE) del genoma de los mamíferos. Existen entre 300.000 y 500.000 copias de elementos repetitivos Alu en el genoma humano, lo que significa que un elemento Alu se encuentra en un rango promedio de 4 a 6 kb. Los elementos Alu están ampliamente distribuidos en el genoma de los mamíferos, y la repetibilidad es una de sus características, de ahí su nombre. Mediante el uso de una secuencia Alu específica como locus diana, se puede obtener ADN humano específico a partir de clones de TAC, BAC, PAC o híbridos de células humano-ratón.

La PCR es una técnica que se utiliza para clonar pequeños fragmentos de ADN. Estos fragmentos pueden ser un gen completo o solo una parte de él. La PCR solo permite clonar fragmentos de ADN muy pequeños, que generalmente no superan los 10 kbp.

La PCR Alu es una técnica de "huella genética". Este método es rápido y fácil de usar. Se obtiene mediante el análisis de numerosos loci genómicos flanqueados por elementos repetitivos Alu, que son retrotransposones no autónomos presentes en gran número de copias en los genomas de primates. ^{[ 14 ]} El elemento Alu puede utilizarse para la huella genética del genoma mediante PCR, también conocida como PCR Alu.

Existen diversas maneras de analizar la función de una secuencia genética específica. El método más directo consiste en reemplazarla o inducir una mutación para luego analizar los resultados y sus efectos. Para ello, se han desarrollado tres métodos: reemplazo genético, supresión de sentido y antisentido, y mutagénesis por inserción . Entre estos métodos, la mutagénesis por inserción ha demostrado ser un enfoque muy eficaz y exitoso.

Al principio, el T-DNA se aplicó para la mutagénesis por inserción. Sin embargo, el uso de elementos transponibles puede brindar más ventajas. Los elementos transponibles fueron descubiertos por primera vez por Barbara McClintock en plantas de maíz . Ella identificó el primer elemento genético transponible, al que llamó locus de disociación (Ds). ^{[ 15 ]} El tamaño del elemento transponible está entre 750 y 40000 pb. Los elementos transponibles se pueden clasificar principalmente en dos clases: una clase es muy simple, llamada secuencia de inserción (IS), la otra clase es compleja, llamada transposón. El transposón tiene uno o varios genes caracterizados, que se pueden identificar fácilmente. IS tiene el gen de la transposasa.

Los transposones pueden utilizarse como marcadores para una secuencia de ADN conocida. Pueden aparecer en otros loci mediante transcripción o retrotranscripción por acción de nucleasas. Esta aparición de transposones demuestra que el genoma no es estático, sino que su estructura está en constante cambio.

El uso de marcadores por transposones ofrece dos ventajas. En primer lugar, si se inserta un transposón en una secuencia genética, esta inserción es única e intacta. Esta integridad facilita el análisis molecular de la secuencia marcada. La otra ventaja es que, al analizar la transposasa , se pueden detectar muchos transposones eliminados de la secuencia genética marcada . Esto confirma que la secuencia genética insertada fue realmente marcada por el transposón. ^{[ 16 ]}