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Genómica funcional

Análisis mutacional profundo del motivo de reconocimiento de ARN (RRM2) de una proteína de unión a poliA de levadura (Pab1). La genómica funcional es un campo de la biología mol...

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Análisis mutacional profundo del motivo de reconocimiento de ARN (RRM2) de una proteína de unión a poliA de levadura (Pab1).

La genómica funcional es un campo de la biología molecular que busca describir las funciones e interacciones de los genes (y las proteínas ). La genómica funcional utiliza la gran cantidad de datos generados por proyectos genómicos y transcriptómicos (como la secuenciación del genoma y la secuenciación del ARN ). Se centra en los aspectos dinámicos, como la transcripción génica , la traducción , la regulación de la expresión génica y las interacciones proteína-proteína , en contraposición a los aspectos estáticos de la información genómica, como la secuencia o la estructura del ADN. Una característica clave de los estudios de genómica funcional es su enfoque a nivel genómico, que generalmente implica métodos de alto rendimiento en lugar del enfoque tradicional de "genes candidatos".

Definición y objetivos

Para comprender la genómica funcional, es importante definir primero la función. En su artículo [ 1 ], Graur et al. definen la función de dos maneras posibles: "efecto selectivo" y "papel causal". La función de "efecto selectivo" se refiere a la función para la cual se selecciona un rasgo (ADN, ARN, proteína, etc.). La función de "papel causal" se refiere a la función para la cual un rasgo es suficiente y necesario. La genómica funcional generalmente pone a prueba la definición de función de "papel causal".

El objetivo de la genómica funcional es comprender la función de los genes o las proteínas, y eventualmente de todos los componentes de un genoma. El término genómica funcional se usa a menudo para referirse a los diversos enfoques técnicos para estudiar los genes y las proteínas de un organismo, incluyendo las "propiedades bioquímicas, celulares y/o fisiológicas de cada producto génico" [ 2 ], mientras que algunos autores incluyen el estudio de elementos no génicos en su definición. [ 3 ] La genómica funcional también puede incluir estudios de la variación genética natural a lo largo del tiempo (como el desarrollo de un organismo) o del espacio (como sus regiones corporales), así como alteraciones funcionales como las mutaciones.

La promesa de la genómica funcional es generar y sintetizar conocimiento genómico y proteómico para comprender las propiedades dinámicas de un organismo. Esto podría proporcionar una visión más completa de cómo el genoma determina la función, en comparación con los estudios de genes individuales. La integración de datos de genómica funcional suele formar parte de los enfoques de biología de sistemas .

Técnicas y aplicaciones

La genómica funcional abarca aspectos del genoma relacionados con la función, como la mutación y el polimorfismo (por ejemplo, el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido [SNP]), así como la medición de actividades moleculares. Estas últimas comprenden diversas disciplinas " -ómicas ", como la transcriptómica ( expresión génica ), la proteómica ( producción de proteínas ) y la metabolómica . La genómica funcional utiliza principalmente técnicas multiplex para medir la abundancia de muchos o todos los productos génicos, como ARNm o proteínas, en una muestra biológica . Un enfoque más específico de la genómica funcional podría evaluar la función de todas las variantes de un gen y cuantificar los efectos de las mutaciones mediante la secuenciación como indicador de actividad. En conjunto, estas modalidades de medición buscan cuantificar los diversos procesos biológicos y mejorar nuestra comprensión de las funciones e interacciones de genes y proteínas.

A nivel de ADN

Mapeo de interacciones genéticas

La eliminación sistemática de genes por pares o la inhibición de la expresión génica pueden utilizarse para identificar genes con funciones relacionadas, incluso si no interactúan físicamente. La epistasis se refiere al hecho de que los efectos de la inactivación de dos genes diferentes pueden no ser aditivos; es decir, el fenotipo resultante de la inhibición de dos genes puede ser distinto de la suma de los efectos de la inactivación de cada gen por separado.

Interacciones ADN/Proteína

Las proteínas formadas por la traducción del ARNm (ARN mensajero, información codificada del ADN para la síntesis de proteínas) desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. Para comprender cómo regulan la expresión génica, es necesario identificar las secuencias de ADN con las que interactúan. Se han desarrollado técnicas para identificar los sitios de interacción ADN-proteína. Estas incluyen la secuenciación ChIP , la secuenciación CUT&RUN y las tarjetas de identificación. [ 4 ]

ensayos de accesibilidad del ADN

Se han desarrollado ensayos para identificar regiones accesibles del genoma. Estas regiones de cromatina accesible son candidatas a regiones reguladoras. Entre estos ensayos se incluyen ATAC-seq , DNase-Seq y FAIRE-Seq .

A nivel de ARN

Microarrays

Un microarreglo de ADN

Los microarrays miden la cantidad de ARNm en una muestra que corresponde a un gen o secuencia de ADN sonda específicos. Las secuencias sonda se inmovilizan en una superficie sólida y se hibridan con el ARNm "diana" marcado con fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia de un punto es proporcional a la cantidad de secuencia diana que se ha hibridado en ese punto y, por lo tanto, a la abundancia de esa secuencia de ARNm en la muestra. Los microarrays permiten identificar genes candidatos implicados en un proceso determinado, basándose en la variación de los niveles de transcripción en diferentes condiciones y en patrones de expresión compartidos con genes de función conocida.

SABIO

El análisis serial de la expresión génica (SAGE) es un método de análisis alternativo basado en la secuenciación de ARN en lugar de la hibridación. SAGE se basa en la secuenciación de marcadores de 10 a 17 pares de bases, únicos para cada gen. Estos marcadores se generan a partir de ARNm poliadenilado y se ligan extremo con extremo antes de la secuenciación. SAGE proporciona una medición objetiva del número de transcritos por célula, ya que no depende del conocimiento previo de qué transcritos estudiar (a diferencia de los microarrays).

secuenciación de ARN

La secuenciación de ARN ha superado a la tecnología de microarrays y SAGE en los últimos años, como se señaló en 2016, y se ha convertido en la forma más eficiente de estudiar la transcripción y la expresión génica. Esto se realiza típicamente mediante secuenciación de nueva generación . [ 5 ]

Un subconjunto de los ARN secuenciados son los ARN pequeños, una clase de moléculas de ARN no codificante que son reguladores clave del silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional, o silenciamiento de ARN . La secuenciación de nueva generación es la herramienta de referencia para el descubrimiento, la caracterización y el análisis de la expresión de ARN no codificante .

Ensayos de reportero masivamente paralelos (MPRA)

Los ensayos de reportero masivamente paralelos son una tecnología utilizada para probar la actividad cis-reguladora de grandes cantidades de secuencias de ADN simultáneamente. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] En un MPRA típico, se genera una biblioteca de decenas de miles de construcciones de ADN de elementos cis-reguladores candidatos , cada uno de estos elementos se vincula a una secuencia de código de barras única y luego se clona en plásmidos que contienen un promotor mínimo y un gen reportero (como luciferasa o proteína verde fluorescente (GFP) [ 7 ] . Estos plásmidos se transfectan en células y se incuban durante un cierto período de tiempo antes de que el material genético se recoja y se secuencie mediante secuenciación de próxima generación . La biblioteca de ADN plasmídico inicial se utiliza como un control de entrada que se compara con la abundancia de ARN del pool para cuantificar la actividad reguladora de cada elemento en el gen reportero corriente abajo [ 8 ] . Los elementos altamente activos producen una gran cantidad de ARN con código de barras, mientras que los elementos inactivos producirán poco o nada.

La mayoría de los MPRA utilizan plásmidos episomales en lugar de secuencias integradas, que no reproducen el contexto genómico endógeno, como las interacciones tridimensionales del ADN o las modificaciones epigenéticas. Para solucionar esto, se puede utilizar un método alternativo conocido como lentiMPRA para integrar de forma estable los constructos reporteros directamente en el genoma del huésped mediante un sistema lentiviral , lo que proporciona un contexto genómico más nativo [ 8 ] [ 9 ] . Una limitación de los MPRA es que la síntesis tradicional de oligonucleótidos restringe los elementos de ADN candidatos a unos pocos cientos de pares de bases. [ 8 ]

STARR-seq

STARR-seq es una técnica similar a MPRA para analizar la actividad potenciadora de fragmentos genómicos obtenidos aleatoriamente. En la publicación original, [ 10 ] se colocaron fragmentos del genoma de Drosophila obtenidos aleatoriamente aguas abajo de un promotor mínimo. Los potenciadores candidatos entre estos fragmentos se transcriben utilizando dicho promotor. Mediante la secuenciación como método de lectura y el control de la cantidad de cada secuencia de entrada, se analiza la fuerza de los potenciadores putativos.

Perturba-seq

Descripción general del flujo de trabajo de Perturb-seq

La técnica Perturb-seq combina la inactivación génica mediada por CRISPR con la expresión génica en células individuales. Se utilizan modelos lineales para calcular el efecto de la inactivación de un solo gen sobre la expresión de múltiples genes.

A nivel de proteínas

Sistema de doble híbrido de levadura

Un sistema de cribado de doble híbrido en levadura (Y2H) prueba una proteína "cebo" frente a muchas proteínas con las que puede interactuar ("presa") para identificar interacciones físicas proteína-proteína. Este sistema se basa en un factor de transcripción, originalmente GAL4, [ 11 ] cuyos dominios separados de unión al ADN y de activación de la transcripción son necesarios para que la proteína induzca la transcripción de un gen reportero. En un cribado Y2H, la proteína "cebo" se fusiona al dominio de unión de GAL4, y una biblioteca de proteínas "presa" (que interactúan) potenciales se expresa recombinantemente en un vector con el dominio de activación. La interacción in vivo de las proteínas cebo y presa en una célula de levadura acerca lo suficiente los dominios de activación y unión de GAL4 como para dar lugar a la expresión de un gen reportero . También es posible probar sistemáticamente una biblioteca de proteínas cebo frente a una biblioteca de proteínas presa para identificar todas las interacciones posibles en una célula.

MS y AP/MS

La espectrometría de masas (EM) permite identificar proteínas y sus niveles relativos, por lo que se puede utilizar para estudiar la expresión proteica. En combinación con la purificación por afinidad , la espectrometría de masas (AP/EM) se puede utilizar para estudiar complejos proteicos, es decir, qué proteínas interactúan entre sí en complejos y en qué proporciones. Para purificar complejos proteicos, generalmente se marca una proteína "cebo" con una proteína o péptido específico que se utiliza para aislar el complejo de una mezcla compleja. La purificación se realiza normalmente mediante un anticuerpo o un compuesto que se une a la parte de fusión. Posteriormente, las proteínas se digieren en fragmentos peptídicos cortos y se utiliza la espectrometría de masas para identificar las proteínas en función de la relación masa-carga de dichos fragmentos.

escaneo mutacional profundo

En el escaneo mutacional profundo, primero se sintetiza cada posible cambio de aminoácido en una proteína dada. [ 12 ] La actividad de cada una de estas variantes proteicas se analiza en paralelo utilizando códigos de barras para cada variante. [ 13 ] Al comparar la actividad con la proteína de tipo silvestre, se identifica el efecto de cada mutación. Si bien es posible analizar cada posible cambio de un solo aminoácido debido a la combinatoria, dos o más mutaciones concurrentes son difíciles de probar. Los experimentos de escaneo mutacional profundo también se han utilizado para inferir la estructura de las proteínas y las interacciones proteína-proteína. [ 14 ] El escaneo mutacional profundo es un ejemplo de ensayos multiplexados de efecto de variante (MAVE), una familia de métodos que implican la mutagénesis de una proteína o elemento regulador codificado por ADN, seguida de un ensayo multiplexado para algún aspecto de la función. Los MAVE permiten la generación de "mapas de efecto de variante" que caracterizan aspectos de la función de cada posible cambio de un solo nucleótido en un gen o elemento funcional de interés. [ 15 ] [ 16 ]

Mutagénesis y fenotipado

Una característica funcional importante de los genes es el fenotipo causado por las mutaciones. Los mutantes pueden producirse por mutaciones aleatorias o por mutagénesis dirigida, incluyendo la mutagénesis dirigida a sitios específicos, la eliminación de genes completos u otras técnicas.

Eliminación de genes (eliminación genética)

La función de los genes puede investigarse mediante la inactivación sistemática de genes uno por uno. Esto se logra mediante la deleción o la alteración de la función (por ejemplo, mediante mutagénesis insercional ), y los organismos resultantes se analizan en busca de fenotipos que proporcionen pistas sobre la función del gen alterado. Se han producido inactivaciones de genomas completos, es decir, mediante la eliminación de todos los genes de un genoma. Para los genes esenciales , esto no es posible, por lo que se utilizan otras técnicas, como la eliminación de un gen mientras se expresa a partir de un plásmido , utilizando un promotor inducible, de modo que el nivel del producto génico pueda modificarse a voluntad (y así lograr una deleción "funcional").

Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida se utiliza para mutar bases específicas (y, por lo tanto, aminoácidos ). Esto es fundamental para investigar la función de aminoácidos específicos en una proteína, por ejemplo, en el sitio activo de una enzima .

ARN de interferencia

Los métodos de interferencia de ARN (ARNi) se pueden utilizar para silenciar o reducir transitoriamente la expresión génica mediante ARN bicatenario de aproximadamente 20 pares de bases, generalmente administrado mediante la transfección de moléculas de ARN de interferencia cortas sintéticas de aproximadamente 20 nucleótidos (siRNA) o mediante ARN de horquilla corta codificados viralmente (shRNA). Los cribados de ARNi, que generalmente se realizan en ensayos basados ​​en cultivos celulares u organismos experimentales (como C. elegans ), se pueden utilizar para interrumpir sistemáticamente casi todos los genes de un genoma o subconjuntos de genes (subgenomas); las posibles funciones de los genes interrumpidos se pueden asignar en función de los fenotipos observados .

pantallas CRISPR

Un ejemplo de una prueba de pérdida de función CRISPR [ 17 ]

CRISPR-Cas9 se ha utilizado para eliminar genes de forma multiplexada en líneas celulares. Cuantificar la cantidad de ARN guía para cada gen antes y después del experimento puede indicar genes esenciales. Si un ARN guía interrumpe un gen esencial, provocará la pérdida de esa célula y, por lo tanto, habrá un agotamiento de ese ARN guía en particular después del cribado. En un experimento reciente de CRISPR-Cas9 en líneas celulares de mamíferos, se encontraron alrededor de 2000 genes como esenciales en múltiples líneas celulares. [ 18 ] [ 19 ] Algunos de estos genes eran esenciales solo en una línea celular. La mayoría de los genes son parte de complejos multiproteicos. Este enfoque se puede utilizar para identificar letalidad sintética utilizando el fondo genético apropiado. CRISPRi y CRISPRa permiten cribados de pérdida de función y ganancia de función de manera similar. CRISPRi identificó ~2100 genes esenciales en la línea celular K562. [ 20 ] [ 21 ] Las técnicas de eliminación CRISPR también se han utilizado para identificar posibles elementos reguladores de un gen. Por ejemplo, se publicó una técnica llamada ScanDel que intentó este enfoque. Los autores eliminaron regiones fuera de un gen de interés (HPRT1 involucrado en un trastorno mendeliano) en un intento de identificar elementos reguladores de este gen. [ 22 ] Gassperini et al. no identificaron ningún elemento regulador distal para HPRT1 utilizando este enfoque, sin embargo, tales enfoques pueden extenderse a otros genes de interés.

Anotaciones funcionales para genes

Anotación del genoma

Los genes putativos pueden identificarse mediante el análisis del genoma en busca de regiones que probablemente codifiquen proteínas, basándose en características como marcos de lectura abiertos largos , secuencias de inicio de la transcripción y sitios de poliadenilación . Una secuencia identificada como gen putativo debe confirmarse con evidencia adicional, como similitud con secuencias de ADNc o EST del mismo organismo, similitud de la secuencia de proteína predicha con proteínas conocidas, asociación con secuencias promotoras o evidencia de que la mutación de la secuencia produce un fenotipo observable.

Enfoque de la piedra Rosetta

El método de la piedra Rosetta es una técnica computacional para la predicción de la función de proteínas de novo. Se basa en la hipótesis de que algunas proteínas implicadas en un proceso fisiológico determinado pueden existir como dos genes separados en un organismo y como un solo gen en otro. Se analizan los genomas en busca de secuencias que sean independientes en un organismo y que formen parte de un único marco de lectura abierto en otro. Si dos genes se han fusionado, se predice que tienen funciones biológicas similares, lo que hace ventajosa dicha corregulación.

Métodos bioinformáticos para la genómica funcional

Debido a la gran cantidad de datos producidos por estas técnicas y al deseo de encontrar patrones biológicamente significativos, la bioinformática es crucial para el análisis de datos de genómica funcional. Ejemplos de técnicas en esta clase son el agrupamiento de datos o el análisis de componentes principales para el aprendizaje automático no supervisado (detección de clases), así como las redes neuronales artificiales o las máquinas de vectores de soporte para el aprendizaje automático supervisado (predicción de clases, clasificación ). El análisis de enriquecimiento funcional se utiliza para determinar el grado de sobreexpresión o subexpresión (reguladores positivos o negativos en el caso de cribados de ARN de interferencia) de categorías funcionales en relación con conjuntos de fondo. El análisis de enriquecimiento basado en ontología génica lo proporcionan DAVID y el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), [ 23 ] el análisis basado en vías por Ingenuity [ 24 ] y Pathway Studio [ 25 ] y el análisis basado en complejos proteicos por COMPLEAT. [ 26 ]

Descripción general del flujo de trabajo de phydms

Se han desarrollado nuevos métodos computacionales para comprender los resultados de un experimento de escaneo mutacional profundo. 'phydms' compara el resultado de un experimento de escaneo mutacional profundo con un árbol filogenético. [ 27 ] Esto permite al usuario inferir si el proceso de selección en la naturaleza aplica restricciones similares a una proteína como indican los resultados del escaneo mutacional profundo. Esto puede permitir a un experimentador elegir entre diferentes condiciones experimentales en función de qué tan bien reflejen la naturaleza. El escaneo mutacional profundo también se ha utilizado para inferir interacciones proteína-proteína. [ 28 ] Los autores utilizaron un modelo termodinámico para predecir los efectos de las mutaciones en diferentes partes de un dímero. La estructura mutacional profunda también se puede utilizar para inferir la estructura de la proteína. Una epistasis positiva fuerte entre dos mutaciones en un escaneo mutacional profundo puede ser indicativa de dos partes de la proteína que están cerca una de la otra en el espacio 3D. Esta información se puede utilizar para inferir la estructura de la proteína. Dos grupos mostraron una prueba de concepto de este enfoque utilizando la proteína GB1. [ 29 ] [ 30 ]

Los resultados de los experimentos MPRA han requerido enfoques de aprendizaje automático para interpretar los datos. Se ha utilizado un modelo SVM de k-meros con huecos para inferir los k-meros que se enriquecen dentro de secuencias cis-reguladoras con alta actividad en comparación con secuencias con menor actividad. [ 31 ] Estos modelos proporcionan un alto poder predictivo. También se han utilizado enfoques de aprendizaje profundo y bosques aleatorios para interpretar los resultados de estos experimentos de alta dimensionalidad. [ 32 ] Estos modelos están comenzando a ayudar a desarrollar una mejor comprensión de la función del ADN no codificante hacia la regulación génica.

Proyectos de consorcio

El proyecto ENCODE

El proyecto ENCODE (Enciclopedia de elementos del ADN) es un análisis exhaustivo del genoma humano cuyo objetivo es identificar todos los elementos funcionales del ADN genómico, tanto en regiones codificantes como no codificantes. Entre los resultados más importantes se incluyen evidencias obtenidas mediante microarrays genómicos que indican que la mayoría de los nucleótidos se transcriben como transcritos codificantes, ARN no codificantes o transcritos aleatorios; el descubrimiento de sitios reguladores transcripcionales adicionales; y una mayor comprensión de los mecanismos de modificación de la cromatina.

El proyecto de Expresión Genotipo-Tejido (GTEx)

Muestras utilizadas y eQTLs descubiertos en GTEx v6

El proyecto GTEx es un proyecto de genética humana cuyo objetivo es comprender el papel de la variación genética en la configuración de la variación del transcriptoma en diferentes tejidos. El proyecto ha recolectado una variedad de muestras de tejido (> 50 tejidos diferentes) de más de 700 donantes post mortem. Esto ha dado como resultado la recolección de más de 11 000 muestras. GTEx ha ayudado a comprender la compartición de tejidos y la especificidad de los eQTL de tejido . [ 33 ] El recurso genómico se desarrolló para "enriquecer nuestra comprensión de cómo las diferencias en nuestra secuencia de ADN contribuyen a la salud y la enfermedad". [ 34 ]

Alianza del Atlas de Efectos Variantes

La Alianza del Atlas de Efectos de Variantes (AVE), [ 35 ] fundada en 2020, es un consorcio internacional que tiene como objetivo catalogar el impacto de todas las variantes genéticas posibles para la genómica funcional relacionada con enfermedades mediante la creación de mapas de efectos de variantes que revelan la función de cada posible cambio de un solo nucleótido en un gen o elemento regulador. AVE está financiada en parte por el Instituto Brotman Baty de la Universidad de Washington y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, a través de la subvención del Centro de Excelencia en Ciencias del Genoma (NHGRI RM1HG010461). [ 36 ]

Véase también

Referencias

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  • Programa de la Fundación Europea de la Ciencia sobre las Fronteras de la Genómica Funcional
  • MUGEN NoE — Genómica funcional integrada en modelos de ratones mutantes
  • Perspectivas de la naturaleza: genómica funcional
  • CODIFICAR
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