Espectroscopia de fluorescencia

La espectroscopia de fluorescencia (también conocida como fluorimetría o espectrofluorometría ) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Consiste en utilizar un haz de luz, generalmente ultravioleta , que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca la emisión de luz; normalmente, aunque no necesariamente, luz visible . Una técnica complementaria es la espectroscopia de absorción . En el caso particular de la espectroscopia de fluorescencia de molécula única, se miden las fluctuaciones de intensidad de la luz emitida por fluoróforos individuales o pares de fluoróforos.

Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros .

Las moléculas poseen diversos estados denominados niveles de energía . La espectroscopia de fluorescencia se centra principalmente en los estados electrónicos y vibracionales. Generalmente, la especie examinada presenta un estado electrónico fundamental (un estado de baja energía) de interés y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos existen diversos estados vibracionales. ^{[ 1 ]}

En la fluorescencia, la especie se excita primero, al absorber un fotón , desde su estado electrónico fundamental a uno de los diversos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas provocan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta alcanzar el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. Este proceso se suele visualizar con un diagrama de Jablonski . ^{[ 1 ]}

La molécula desciende entonces a uno de los diversos niveles vibracionales del estado electrónico fundamental, emitiendo un fotón en el proceso. ^{[ 1 ]} Dado que las moléculas pueden descender a cualquiera de los diversos niveles vibracionales del estado fundamental, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, diferentes frecuencias. Por consiguiente, al analizar las diferentes frecuencias de luz emitidas en la espectroscopia de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles vibracionales.

Para las especies atómicas, el proceso es similar; sin embargo, dado que las especies atómicas no poseen niveles de energía vibracional, los fotones emitidos suelen tener la misma longitud de onda que la radiación incidente. Este proceso de reemisión del fotón absorbido se denomina "fluorescencia de resonancia" y, si bien es característico de la fluorescencia atómica, también se observa en la fluorescencia molecular. ^{[ 2 ]}

En una medición típica de fluorescencia (emisión), la longitud de onda de excitación (la longitud de onda de la luz incidente utilizada para excitar el fluoróforo) es fija y la longitud de onda de detección varía (produciendo un espectro de emisión) , mientras que en una medición de excitación de fluorescencia la longitud de onda de detección es fija y la longitud de onda de excitación varía en una región de interés para producir un espectro de excitación . Se obtiene una matriz de excitación-emisión registrando los espectros de emisión resultantes de un rango de longitudes de onda de excitación y combinándolos todos. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Este es un conjunto de datos de superficie tridimensional: intensidad de emisión en función de las longitudes de onda de excitación y emisión, y se representa típicamente como un mapa de contorno.

Existen dos tipos generales de instrumentos: los fluorómetros de filtro , que utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente , y los espectrofluorómetros , que utilizan monocromadores de rejilla de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.

Ambos tipos utilizan el siguiente esquema: la luz de una fuente de excitación atraviesa un filtro o monocromador e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de sus moléculas emiten fluorescencia. La luz fluorescente se emite en todas direcciones. Parte de esta luz fluorescente atraviesa un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, que generalmente se coloca a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente transmitida o reflejada llegue al detector.

Se pueden utilizar diversas fuentes de luz como fuentes de excitación, incluyendo láseres, LED y lámparas; en particular, arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio  . Un láser solo emite luz de alta irradiancia en un intervalo de longitud de onda muy estrecho, generalmente inferior a 0,01 nm, lo que hace innecesario un monocromador o filtro de excitación. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede modificar significativamente. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca de las longitudes de onda máximas. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con una intensidad casi constante en el rango de 300 a 800  nm y una irradiancia suficiente para realizar mediciones hasta ligeramente por encima de los 200  nm.

En los fluorímetros se pueden utilizar filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de longitud de onda ajustable con una tolerancia regulable. El tipo más común de monocromador utiliza una rejilla de difracción; es decir, la luz colimada incide sobre la rejilla y sale con un ángulo diferente según la longitud de onda. El monocromador se puede ajustar para seleccionar las longitudes de onda que se transmiten. Para permitir mediciones de anisotropía, es necesario añadir dos filtros de polarización: uno después del monocromador o filtro de excitación y otro antes del monocromador o filtro de emisión.

Como se mencionó anteriormente, la fluorescencia se mide con mayor frecuencia a un ángulo de 90° con respecto a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación a un ángulo de 180° para evitar la interferencia de la luz de excitación transmitida. Ningún monocromador es perfecto y transmitirá algo de luz parásita , es decir, luz con longitudes de onda distintas a la deseada. Un monocromador ideal solo transmitiría luz en el rango especificado y tendría una alta transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir a un ángulo de 90°, solo la luz dispersada por la muestra causa luz parásita. Esto resulta en una mejor relación señal-ruido y reduce el límite de detección en aproximadamente un factor de 10000, ^{[ 5 ]} en comparación con la geometría de 180°. Además, la fluorescencia también se puede medir desde el frente, lo que se suele hacer para muestras turbias u opacas. ^{[ 6 ]}

El detector puede ser monocanal o multicanal. El detector monocanal solo detecta la intensidad de una longitud de onda a la vez, mientras que el multicanal detecta la intensidad de todas las longitudes de onda simultáneamente, lo que hace innecesario el monocromador o filtro de emisión.

Los fluorímetros más versátiles, con monocromadores duales y una fuente de luz de excitación continua, pueden registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, preferiblemente a una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro o monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de excitación realiza el escaneo. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción, ya que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la absorción. ^{[ 7 ]}

A bajas concentraciones, la intensidad de la fluorescencia será generalmente proporcional a la concentración del fluoróforo .

A diferencia de la espectroscopia UV/visible, no es fácil obtener espectros "estándar" e independientes del dispositivo. Varios factores influyen y distorsionan los espectros, y se requieren correcciones para obtener espectros "verdaderos", es decir, independientes del instrumento. Los diferentes tipos de distorsiones se clasificarán aquí como relacionadas con el instrumento o con la muestra. En primer lugar, se analiza la distorsión derivada del instrumento. Para empezar, la intensidad de la fuente de luz y las características de la longitud de onda varían con el tiempo durante cada experimento y entre experimentos. Además, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las longitudes de onda. Para corregir esto, se puede aplicar un divisor de haz después del monocromador o filtro de excitación para dirigir una parte de la luz a un detector de referencia.

Además, debe tenerse en cuenta la eficiencia de transmisión de los monocromadores y filtros, la cual puede variar con el tiempo. La eficiencia de transmisión del monocromador también depende de la longitud de onda. Por ello, se recomienda colocar un detector de referencia opcional después del monocromador o filtro de excitación. El porcentaje de fluorescencia captada por el detector también depende del sistema. Asimismo, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre diferentes detectores, con la longitud de onda y con el tiempo, debido al inevitable deterioro del detector.

Otros dos aspectos que deben considerarse son la óptica utilizada para dirigir la radiación y el sistema para contener la muestra (denominado cubeta o celda). Para la mayoría de las mediciones en el rango UV, visible e infrarrojo cercano (NIR), es necesario utilizar cubetas de cuarzo de precisión. En ambos casos, es importante seleccionar materiales con una absorción relativamente baja en el rango de longitud de onda de interés. El cuarzo es ideal porque transmite desde 200  nm hasta 2500  nm; el cuarzo de mayor calidad puede incluso transmitir hasta 3500  nm, mientras que las propiedades de absorción de otros materiales pueden enmascarar la fluorescencia de la muestra.

La corrección de todos estos factores instrumentales para obtener un espectro "estándar" es un proceso tedioso que solo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Este es el caso, por ejemplo, al medir el rendimiento cuántico o al encontrar la longitud de onda con la mayor intensidad de emisión.

Como se mencionó anteriormente, las distorsiones también surgen de la muestra. Por lo tanto, algunos aspectos de la muestra también deben tenerse en cuenta. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. La dispersión de la luz también debe tenerse en cuenta. Los tipos de dispersión más significativos en este contexto son la dispersión de Rayleigh y la dispersión de Raman. La luz dispersada por la dispersión de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión de Raman la luz dispersada cambia de longitud de onda generalmente a longitudes de onda más largas. La dispersión de Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. Desde este estado virtual , las moléculas pueden relajarse de vuelta a un nivel vibracional distinto del estado vibracional fundamental. ^{[ 9 ]} En los espectros de fluorescencia, siempre se observa en una diferencia de número de onda constante en relación con el número de onda de excitación, por ejemplo, el pico aparece en un número de onda 3600  cm ⁻¹ menor que la luz de excitación en el agua.

Otros aspectos a considerar son los efectos de filtro interno. ^{[ 10 ] [ 11 ]} Estos incluyen la reabsorción. La reabsorción ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe en las longitudes de onda en las que el fluoróforo emite radiación. Si esto sucede, algunos o todos los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos nuevamente. Otro efecto de filtro interno se produce debido a altas concentraciones de moléculas absorbentes, incluido el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de la luz de excitación no es constante en toda la solución. En consecuencia, solo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos de filtro interno cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por lo tanto, deben considerarse al analizar el espectro de emisión de la luz fluorescente. ^{[ 7 ] [ 12 ]}

La fluorescencia de una proteína plegada es una mezcla de la fluorescencia de residuos aromáticos individuales. La mayor parte de las emisiones de fluorescencia intrínsecas de una proteína plegada se deben a la excitación de residuos de triptófano , con algunas emisiones debidas a tirosina y fenilalanina; pero los enlaces disulfuro también tienen una absorción apreciable en este rango de longitud de onda. Típicamente, el triptófano tiene una longitud de onda de máxima absorción de 280  nm y un pico de emisión que es solvatocrómico , que varía de aproximadamente 300 a 350  nm dependiendo de la polaridad del entorno local ^{[ 13 ]} Por lo tanto, la fluorescencia de la proteína puede usarse como diagnóstico del estado conformacional de una proteína. ^{[ 14 ]} Además, la fluorescencia del triptófano está fuertemente influenciada por la proximidad de otros residuos ( es decir , los grupos protonados cercanos como Asp o Glu pueden causar la extinción de la fluorescencia de Trp). Además, es posible la transferencia de energía entre el triptófano y los demás aminoácidos fluorescentes, lo que afectaría al análisis, especialmente en los casos en que se utilice el método ácido de Förster. Asimismo, el triptófano es un aminoácido relativamente escaso; muchas proteínas contienen solo uno o pocos residuos de triptófano. Por lo tanto, la fluorescencia del triptófano puede ser una medida muy sensible del estado conformacional de residuos individuales de triptófano. La ventaja en comparación con las sondas extrínsecas es que la proteína en sí no se modifica. El uso de la fluorescencia intrínseca para el estudio de la conformación de proteínas se limita, en la práctica, a casos con pocos (o quizás solo uno) residuos de triptófano, ya que cada uno experimenta un entorno local diferente, lo que da lugar a distintos espectros de emisión.

El triptófano es un importante aminoácido fluorescente intrínseco, que puede utilizarse para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano. Al realizar experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas , el microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si una proteína que contiene un solo triptófano en su núcleo "hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de la temperatura, aparecerá un espectro de emisión desplazado hacia el rojo. Esto se debe a la exposición del triptófano a un entorno acuoso en lugar de un interior proteico hidrofóbico. Por el contrario, la adición de un surfactante a una proteína que contiene un triptófano expuesto al disolvente acuoso provocará un espectro de emisión desplazado hacia el azul si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela del surfactante . ^{[ 15 ]} Las proteínas que carecen de triptófano pueden acoplarse a un fluoróforo .

Con una excitación de fluorescencia a 295 nm, el espectro de emisión del triptófano predomina sobre la fluorescencia más débil de la tirosina y la fenilalanina .

Las proteínas fluorescentes resueltas en el tiempo (TRFP) son biomoléculas derivadas de proteínas fluorescentes naturales como la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria . Las TRFP emiten fluorescencia durante intervalos limitados (1-10 nanosegundos) que varían con factores ambientales como el pH o las interacciones moleculares. Iniciadas a principios de la década de 2000, las TRFP mejoran la microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM), ofreciendo un contraste superior a los métodos basados ​​en intensidad al minimizar la autofluorescencia y permitir la multiplexación de señales. ^{[ 16 ]}

Las TRFP emiten luz tras la excitación, y su tiempo de vida se mide mediante el recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo. Variantes como mTFP1 (verde azulado, ~2,6 ns) y mScarlet-I (rojo, ~3,1 ns) presentan altos rendimientos cuánticos y fotoestabilidad, lo que las hace idóneas para la obtención de imágenes de células vivas. Las TRFP, codificadas genéticamente, se integran en las células mediante plásmidos , lo que permite el seguimiento no invasivo de eventos como el plegamiento de proteínas, la señalización iónica o la actividad enzimática. ^{[ 16 ]}

Las TRFP optimizadas mediante IA presentan tiempos de vida prolongados y emisiones más brillantes, lo que impulsa la microscopía de superresolución. Las TRFP se utilizan en organismos modelo como, por ejemplo, Drosophila y el pez cebra . Entre los desafíos se incluyen los riesgos de fotoblanqueo, la instrumentación FLIM compleja y la penetración limitada en tejidos profundos debido a la dispersión. Las variantes con desplazamiento al rojo podrían solucionar este problema. ^{[ 16 ]}

Otras investigaciones intentan combinar TRFP con CRISPR para estudios de genes específicos. ^{[ 16 ]}

La integración en el diagnóstico clínico, como la detección de microambientes tumorales , requiere una técnica FLIM rentable. La investigación actual busca mejorar el brillo, reducir la toxicidad y ampliar los rangos espectrales. ^{[ 16 ]}

En 2025, los investigadores crearon 28 nuevos TRFP, añadiendo colores e intervalos de tiempo que ofrecen muchas más opciones para utilizar la técnica. Mutaron algunos de los residuos de aminoácidos para desestabilizar la región que generaba la señal fluorescente. ^{[ 17 ]}

La espectroscopia de fluorescencia se utiliza, entre otros campos, en la investigación bioquímica, médica y química para el análisis de compuestos orgánicos . También se ha documentado su uso para diferenciar tumores cutáneos malignos de benignos.

Las técnicas de espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS) son útiles en otros tipos de análisis/medición de un compuesto presente en el aire o el agua, u otros medios, como la CVAFS , que se utiliza para la detección de metales pesados, como el mercurio.

La fluorescencia también puede utilizarse para redirigir fotones; véase colector solar fluorescente .

Además, la espectroscopia de fluorescencia se puede adaptar al nivel microscópico mediante microfluorimetría.

En química analítica, los detectores de fluorescencia se utilizan con HPLC .

En el campo de la investigación del agua, la espectroscopia de fluorescencia puede utilizarse para monitorear la calidad del agua mediante la detección de contaminantes orgánicos. ^{[ 18 ]} Los avances recientes en informática y aprendizaje automático incluso han permitido la detección de la contaminación bacteriana del agua. ^{[ 19 ]}

En la investigación biomédica, la espectroscopia de fluorescencia se utiliza para evaluar la eficiencia de la distribución de fármacos mediante la reticulación de agentes fluorescentes a diversos fármacos. ^{[ 20 ]}

La espectroscopia de fluorescencia en la investigación biofísica permite visualizar y caracterizar dominios lipídicos dentro de las membranas celulares. ^{[ 21 ]}

Las proteínas TFRP se utilizan en la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) para estudiar la proximidad molecular y monitorizar los cambios metabólicos en enfermedades como el cáncer o la neurodegeneración .

• Sondas de lantánidos
• Fotoluminiscencia
• Fluorescencia inducida por láser

• Fluorophores.org , la base de datos de colorantes fluorescentes
• OpenFluor , herramientas comunitarias que apoyan el análisis quimiométrico de la fluorescencia de la materia orgánica.
• Base de datos de minerales fluorescentes con imágenes, activadores y espectros (fluomin.org)