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Fotometría de fibra

La fotometría de fibra es una técnica de imagen de calcio que captura la actividad de calcio (Ca2 + ) a nivel poblacional o de "masa" [ 1 ] de tipos celulares específicos dentro...

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La fotometría de fibra es una técnica de imagen de calcio que captura la actividad de calcio (Ca2 + ) a nivel poblacional o de "masa" [ 1 ] de tipos celulares específicos dentro de una región cerebral o red funcional para estudiar circuitos neuronales [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]. La actividad de calcio a nivel poblacional puede correlacionarse con tareas conductuales, como el aprendizaje espacial, la recuperación de la memoria y las conductas dirigidas a objetivos [ 7 ] . La técnica implica la implantación quirúrgica de fibras ópticas en el cerebro de animales vivos. Las ventajas para los investigadores son que las fibras ópticas son más sencillas de implantar, menos invasivas y menos costosas que otros métodos de calcio, y hay menos peso y estrés para el animal, en comparación con los miniscopios. También permite la obtención de imágenes de múltiples regiones cerebrales que interactúan y la integración con otras técnicas de neurociencia. Las limitaciones de la fotometría de fibra son la baja resolución celular y espacial, y el hecho de que los animales deben estar sujetos de forma segura a un haz de fibras rígido, lo que puede afectar el comportamiento naturalista de mamíferos pequeños como los ratones.

Descripción técnica

La fotometría de fibra se basa en la expresión de indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP o RCaMP, que pueden dirigirse a células específicas mediante promotores específicos de células como la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKII) y la sinapsina humana (hSyn), que confieren expresión neuronal excitatoria y pan-neuronal, respectivamente. [ 1 ] Estos promotores pueden utilizarse para dirigirse a diversos subtipos neuronales, así como a células no neuronales que presentan dinámica de calcio, como los astrocitos , mediante el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) . [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] Tanto en neuronas como en astrocitos, la actividad celular en forma de potenciales de acción, exocitosis de neurotransmisores, cambios en la plasticidad sináptica y transcripción génica está acoplada a un influjo de iones Ca2 + . [ 5 ]

Estos cambios en los niveles de calcio intracelular, dependientes de la actividad, pueden monitorizarse introduciendo GECI en la célula. Cuando la concentración de iones de calcio es baja, los GECI muestran una fluorescencia débil o nula. Tras la entrada de iones , las proteínas fluorescentes que contienen los GECI (como mScarlet o GFP ) se activan al unirse al Ca²⁺ . La irradiación de estas proteínas con luz de la longitud de onda adecuada, transmitida a través de la fotofibra, excita los GECI, ahora fluorescentes, que a su vez emiten fotones de menor longitud de onda ( desplazamiento de Stokes ). Estos fotones se reflejan a través de la fotofibra y son detectados.

El cambio en la fluorescencia corresponde proporcionalmente a los cambios de calcio intracelular. [ 12 ] El indicador de calcio más comúnmente utilizado para la fotometría de fibra (y otros métodos de imágenes in vivo ) es GCaMP6, aunque se siguen desarrollando GECI adicionales con espectros de fluorescencia, cinética, relaciones señal-ruido y sensibilidades al calcio únicos. [ 13 ] [ 14 ] Estos indicadores pueden expresarse en el cerebro de dos maneras principales: expresión viral [ 15 ] y líneas de ratones transgénicos . [ 16 ] Recientemente, ha habido una lista creciente de indicadores que se han vuelto disponibles para medir diferentes señales químicas, como dLight para registrar la señalización de dopamina , u OxLight para registrar la orexina , por ejemplo. [ 15 ] [ 17 ] [ 18 ] GCaMP, RCaMP, dLight y otros indicadores son excitados por una fuente de luz a una longitud de onda óptima y emiten su propia luz a cambio, lo que permite registrar la dinámica del calcio o de los neurotransmisores a lo largo del tiempo. [ 3 ] [ 15 ] [ 19 ] [ 13 ] [ 20 ] [ 21 ]

Los sistemas de fotometría de fibra están diseñados para proporcionar longitudes de onda de excitación de luz precisas que son específicas para un indicador de calcio (p. ej., GCaMP) o neurotransmisor (p. ej., dLight). [ 3 ] Esta luz viaja a través de una fibra óptica hasta una fibra óptica implantada en la región o regiones de interés del cerebro. El indicador de calcio, que se expresa de manera específica para cada tipo de célula, es excitado por esta luz y, a su vez, emite su propia señal que viaja de regreso a través de la misma fibra. [ 3 ] [ 4 ] [ 22 ] Estas señales de emisión recolectadas se separan espectralmente mediante un espejo dicroico, se filtran y se enfocan en un fotodetector, una cámara científica o un PMT. [ 3 ] La señal recolectada representa un cambio en la fluorescencia (ΔF) con respecto a una línea base inicial (F). A su vez, los investigadores pueden observar una señal que corresponde a transitorios de calcio (ΔF/F). Estos datos de series temporales se pueden analizar utilizando una variedad de pipelines de código abierto, como pMAT , [ 23 ] pyPhotometry [ 24 ] y GuPPy . [ 25 ]

Es importante destacar que las señales isobésticas son señales independientes del calcio (aproximadamente 405-415  nm) que contrastan con la longitud de onda dependiente del calcio (470  nm para GCaMP). Debido a que GCaMP tiene dos estados, unido y no unido a Ca²⁺, las dos conformaciones de la proteína presentan espectros de excitación y emisión únicos. La longitud de onda de excitación a la que GCaMP tiene la misma absorbancia con y sin Ca²⁺ es la isobéstica y determina la línea base de fluorescencia independiente del calcio. El movimiento del animal y la autofluorescencia del tejido se reflejan en esta señal independiente del calcio y pueden restarse o corregirse para revelar el verdadero cambio en la fluorescencia. [ 26 ]

Estructura de GCaMP, un indicador de calcio codificado genéticamente que se utiliza comúnmente en métodos de obtención de imágenes de calcio, como la fotometría de fibra y la microscopía de uno y dos fotones.

Indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI)

Expresión

La expresión óptima de indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se puede lograr de dos maneras: vectores virales adenoasociados y líneas de roedores transgénicos . [ 15 ] [ 16 ] La inyección viral requiere la infusión de GECI en la región cerebral de interés . [ 15 ] Este virus se puede dirigir para infectar tipos celulares únicos mediante el uso de promotores específicos de células como CaMKII y GFAP para dirigirse a neuronas excitadoras y astrocitos, respectivamente. Esto permite registrar la actividad neuronal de una subpoblación genéticamente definida de neuronas o células gliales a través de una fibra óptica implantada. [ 1 ] La expresión viral requiere la titulación de diluciones para obtener una expresión óptima en el cerebro, lo que puede ser necesario en lugar de usar líneas de roedores transgénicos para ciertos experimentos. La expresión de GECI también se puede lograr mediante el uso de líneas transgénicas que permiten una expresión ubicua en todo el cerebro. Dependiendo de la cepa de ratón o rata, la expresión puede variar entre las regiones cerebrales, lo que plantea posibles desafíos durante el registro. [ 16 ]

GCaMP

GCaMP es un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) que se utiliza comúnmente en múltiples métodos de imagen. [ 19 ] GCaMP emite fluorescencia cuando el indicador se une a un ion calcio (Ca 2+ ). Esta señal de calcio está directamente relacionada con los patrones de respuesta neuronal, la liberación de neurotransmisores y la excitabilidad de la membrana. [ 27 ] Las longitudes de onda de excitación para GCaMP y su señal isobéstica son aproximadamente 470  nm y 415  nm (azul), respectivamente. El objetivo es fotoexcitar los puntos de máxima absorción e isobésticos del indicador. El punto isobéstico de GCaMP es la señal independiente del calcio, aproximadamente 405-415  nm. Esto se determina en función de que GCaMP tiene dos estados funcionales: unido y no unido a iones calcio. Estos dos estados tienen espectros de excitación y emisión de proteínas únicos. La longitud de onda de excitación donde estos dos estados de proteína tienen la misma absorbancia es el punto isobéstico y determina la fluorescencia de referencia. El movimiento y la autofluorescencia se reflejan en esta señal independiente del calcio y pueden restarse o corregirse para revelar el verdadero cambio en la fluorescencia celular durante una tarea conductual o manipulación experimental. [ 26 ]

La longitud de onda de emisión de GCaMP es de aproximadamente 525  nm (verde), lo que permite analizarla y correlacionarla a lo largo del tiempo durante las tareas conductuales.

Fotometría de fibra multicolor

Para observar la dinámica simultánea del calcio en múltiples tipos de células, los investigadores han combinado dos o más GECI en una sola región cerebral. [ 3 ] [ 28 ] Por ejemplo, un grupo de investigación registró la fluorescencia de los GECI verdes y rojos, GCaMP6f y jRGECO1a, que se expresaban diferencialmente en neuronas de proyección espinosas de la vía directa e indirecta del cuerpo estriado en ratones en libre movimiento. [ 29 ] La expresión de múltiples GECI en la misma región cerebral no solo se puede realizar en dos conjuntos de neuronas, como se muestra en el estudio anterior. Estos registros simultáneos de calcio global también se pueden realizar con múltiples tipos de células, como neuronas y astrocitos. Estos tipos de células expresan promotores únicos, como GFAP y hSyn, y los GECI se pueden dirigir específicamente de esta manera. Otro grupo de investigación realizó con éxito fotometría de fibra de doble color utilizando promotores específicos de astrocitos y neuronas mientras los ratones realizaban libremente una tarea de memoria de trabajo (laberinto en T). [ 30 ]

Ejemplo de indicador de calcio codificado genéticamente (GECI), Lck-GCaMP3, expresado en astrocitos de cortes cerebrales agudos durante una sesión de obtención de imágenes de calcio.

Equipo

El objetivo de la fotometría de fibra es administrar, extraer y registrar con precisión la señal de calcio global de poblaciones celulares específicas dentro de una región cerebral de interés. Para acceder a la señal, se debe implantar quirúrgicamente una cánula/fibra óptica en el sitio de expresión de GECI. Esta fibra óptica solo puede recolectar la señal de calcio a nivel poblacional, no la actividad celular individual. [ 1 ] Además, las fibras ópticas permiten el registro tanto de estructuras cerebrales profundas como superficiales, y minimizan el daño tisular a diferencia de las lentes GRIN o las ventanas corticales.

GCaMP tiene espectros de excitación y emisión específicos a aproximadamente 470  nm y 530  nm, respectivamente. [ 27 ] Las fuentes de luz LED se encuentran entre las más seleccionadas, debido a la baja potencia óptica necesaria para excitar los GECI. La transmisión adecuada de las señales de excitación y emisión bidireccionalmente desde el cerebro al dispositivo de imagen se coordina mediante espejos dicroicos y filtros de excitación/emisión. Hay tres tipos diferentes de dispositivos de imagen: fotodetectores , tubos fotomultiplicadores (PMT) y cámaras científicas . Cuando se recoge la señal de una sola región del cerebro, es típico usar un fotodetector o un PMT debido a su rápida adquisición y alta relación señal-ruido (SNR). Alternativamente, cuando se recoge de múltiples regiones del cerebro, se deben usar cámaras científicas o múltiples fotodetectores o PMT.

En resumen, este sistema permite el acoplamiento entre la cánula óptica, la fuente de luz y el dispositivo de imagen. La cánula/fibra óptica permite la administración precisa de luz al GECI, y el dispositivo de imagen recoge la señal de emisión durante la grabación.

Algunos ejemplos de sistemas de fotometría de fibra disponibles comercialmente incluyen Neurophotometrics , Inscopix y MightexBio .

Beneficios y limitaciones

Todos los métodos científicos conllevan consideraciones que deben tenerse en cuenta antes de su uso. La fotometría de fibra óptica ofrece muchas ventajas sobre otras técnicas para la obtención de imágenes de calcio, pero también presenta limitaciones.

Beneficios

Para los investigadores de laboratorio que desean integrar la obtención de imágenes de calcio en sus experimentos, pero que aún no cuentan con los recursos financieros o técnicos necesarios, la fotometría de fibra óptica ofrece una baja barrera de entrada. Las fibras ópticas son más fáciles de implantar, menos invasivas y más económicas que otros métodos de medición de calcio, como la obtención de imágenes de uno o dos fotones. [ 14 ] Es adecuada para paradigmas conductuales longitudinales [ 31 ] porque ejerce menos peso y estrés sobre el animal, en comparación con los miniscopios. Limita la movilidad del animal significativamente menos que otros métodos, lo que permite comportamientos más naturales y con mayor libertad de movimiento en modelos de roedores más grandes. Es una técnica versátil que permite la obtención de imágenes de múltiples regiones cerebrales que interactúan entre sí y su integración con la optogenética, [ 32 ] la electrofisiología [ 33 ] y técnicas de neurociencia a nivel de sistemas. Más recientemente, esta técnica se puede combinar con otros indicadores fluorescentes para la actividad de neurotransmisores o cambios de pH. [ 15 ] [ 21 ]

Limitaciones

Es importante al planificar experimentos considerar la principal limitación de la fotometría de fibra: la baja resolución celular y espacial. Esta falta de resolución óptica puede atribuirse a la recolección de una agregación de actividad dentro de un campo de visión, lo que solo permite cambios "a granel" en la señal fluorescente. [ 5 ] Aunque el tamaño de una cánula óptica es mucho menor que la tecnología utilizada en otros métodos de imágenes de calcio, como la microscopía de uno y dos fotones, los animales deben estar sujetos de forma segura a un haz de fibra rígido. [ 1 ] Esto puede limitar el comportamiento naturalista y de mamíferos más pequeños, como los ratones.

Integración con otros métodos

Rata sometida a estimulación optogenética mediante un implante de fibra óptica. Este método puede combinarse con fotometría de fibra para manipular y medir la dinámica del calcio poblacional dentro de un circuito neuronal.

Optogenética y DREADD

La fotometría de fibra se puede integrar con la manipulación celular para establecer un vínculo causal entre la actividad neuronal y el comportamiento. La modulación dirigida de tipos celulares y proyecciones definidos en el cerebro se puede lograr mediante optogenética o receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) . [ 14 ] El método se elige en función de la precisión temporal necesaria para el diseño experimental, entre otros factores. La optogenética permite la manipulación de un tipo celular específico con alta precisión temporal. Los DREADD tienen una precisión temporal mucho menor debido a la farmacocinética del ligando, como el clozapina-N-óxido (CNO) [ 34 ] o la descloroclozapina (DCZ). [ 35 ] Es importante señalar que la lectura óptica simultánea y la manipulación optogenética conllevan varios problemas potenciales que se analizan a continuación. [ 32 ]

Electrofisiología in vivo

Además, la fotometría de fibra se puede acoplar con la electrofisiología in vivo en el mismo animal. [ 33 ] Cuando se combinan, esta combinación de registro electrofisiológico e imágenes de calcio se puede utilizar para observar la actividad específica de cada tipo celular con lecturas de mayor precisión temporal de los potenciales de acción neuronales en modelos animales en libre movimiento.

Problemas y soluciones potenciales

La administración y expresión de sondas optogenéticas e indicadores de calcio en las mismas neuronas puede presentar problemas. Los indicadores de calcio y los canales de manipulación pueden tener espectros de excitación superpuestos, como GCaMP y la canalrodopsina (ChR2) , que presentan una longitud de onda de excitación máxima de aproximadamente 470  nm. La excitación del indicador de calcio puede activar el canal iónico fotosensible optogenético. El cambio medido en la señal de calcio no puede atribuirse fácilmente a cambios reales en el calcio o a la señal inducida por la optogenética. Las soluciones a este problema incluyen la combinación de indicadores con espectros de excitación distintos a los de la sonda optogenética o el indicador de calcio. Los indicadores de calcio (GCaMP, RCaMP) y las sondas optogenéticas para la excitación (ChR2, Crimson) y la inhibición ( eNpHR , Arch , Jaws) son opciones viables.

Otros métodos de obtención de imágenes de calcio

Imágenes de calcio multifotónicas de neuronas cerebelosas de ratón durante un pellizco en la cola. El cambio en la fluorescencia con respecto a la fluorescencia basal (dF/F) y los datos brutos se muestran arriba.

Miniscopios e imágenes de fotones individuales

Los miniscopios [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] son ​​microscopios miniatura montados en la cabeza que permiten la obtención de imágenes de grandes poblaciones de actividad neuronal en ratones y ratas en libre movimiento. Esto es posible debido a su pequeño tamaño, ya que son lo suficientemente ligeros como para que un ratón o una rata los transporten fácilmente sin interferir significativamente con su comportamiento. Los investigadores combinan los miniscopios con lentes de índice de refracción de gradiente (GRIN) implantadas o ventanas corticales que permiten la obtención de imágenes cerebrales profundas y superficiales. [ 38 ] [ 5 ] [ 40 ] Este método es ideal para monitorear la actividad de cientos de células definidas genética y espacialmente dentro de un solo animal. [ 37 ] En comparación con la fotometría de fibra, los miniscopios permiten la obtención de imágenes con alta resolución celular, detectando cambios en el calcio dentro de neuronas individuales y células no neuronales. [ 36 ] Además, este método permite la obtención de imágenes repetidas a lo largo del tiempo para analizar la transición de estados "saludables" a patológicos o cambios en el curso del comportamiento. [ 37 ] Sin embargo, este método de imagen tiene baja sensibilidad y alto ruido, lo que produce imágenes de menor resolución en comparación con otros métodos multifotónicos como el de dos fotones. [ 7 ] Estos microscopios en miniatura tienen limitaciones en su capacidad para detectar indicadores desplazados al rojo lejano que serían necesarios para la combinación de optogenética e imágenes de calcio aquí, como se discute más arriba.

Imágenes de dos fotones

La imagen de dos fotones [ 41 ] [ 5 ] es otro método de imagen de calcio que registra fluctuaciones en la dinámica celular de GECI. Proporciona una forma de penetrar el tejido cerebral altamente dispersor de luz hasta 600-700 micras por debajo de la superficie del cerebro. [ 36 ] [ 42 ] En comparación con otras técnicas, la imagen de dos fotones ofrece una mayor resolución espacial celular y subcelular, como dentro de las dendritas y los botones axónicos, dentro de un plano focal bien definido. [ 36 ] [ 41 ] Sin embargo, sin la ayuda de una cánula óptica o un microendoscopio, este método se limita a áreas cerebrales más superficiales. [ 36 ] [ 43 ] [ 44 ] Este tipo de imagen también requiere que los animales permanezcan con la cabeza fija, lo que limita los comportamientos naturalistas necesarios para algunas tareas conductuales complejas. [ 41 ] [ 36 ]

Referencias

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