Mapeo de epítopos

En inmunología , el mapeo de epítopos es el proceso de identificar experimentalmente el sitio de unión, o epítopo , de un anticuerpo en su antígeno diana (generalmente, en una proteína ). ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} La identificación y caracterización de los sitios de unión de anticuerpos ayudan en el descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias , vacunas y diagnósticos . ^{[ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]} La caracterización de epítopos también puede ayudar a dilucidar el mecanismo de unión de un anticuerpo ^{[ 9 ]} y puede fortalecer la protección de la propiedad intelectual (patente). ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]} Los datos experimentales de mapeo de epítopos pueden incorporarse a algoritmos robustos para facilitar la predicción in silico de epítopos de células B basada en datos de secuencia y/o estructura. ^{[ 13 ]}

Los epítopos generalmente se dividen en dos clases: lineales y conformacionales/discontinuos. Los epítopos lineales están formados por una secuencia continua de aminoácidos en una proteína . Los epítopos conformacionales están formados por aminoácidos que están cerca en la estructura 3D plegada pero distantes en la secuencia de la proteína. ^{[ 14 ]} Cabe señalar que los epítopos conformacionales pueden incluir algunos segmentos lineales. Los estudios de mapeo de epítopos de células B sugieren que la mayoría de las interacciones entre antígenos y anticuerpos, particularmente autoanticuerpos y anticuerpos protectores (por ejemplo, en vacunas), dependen de la unión a epítopos discontinuos.

Al proporcionar información sobre el mecanismo de acción , el mapeo de epítopos es un componente crítico en el desarrollo de anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb). El mapeo de epítopos puede revelar cómo un mAb ejerce sus efectos funcionales, por ejemplo, bloqueando la unión de un ligando o atrapando una proteína en un estado no funcional. Muchos mAb terapéuticos se dirigen a epítopos conformacionales que solo están presentes cuando la proteína está en su estado nativo (plegada correctamente), lo que puede dificultar el mapeo de epítopos. ^{[ 15 ]} El mapeo de epítopos ha sido crucial para el desarrollo de vacunas contra patógenos virales prevalentes o mortales, como el chikungunya , ^{[ 16 ]} el dengue , ^{[ 17 ]} el ébola , ^{[ 5 ] [ 18 ] [ 19 ]} y los virus del Zika , ^{[ 20 ]} al determinar los elementos antigénicos (epítopos) que confieren efectos de inmunización duraderos. ^{[ 21 ]}

Los antígenos diana complejos, como las proteínas de membrana (p. ej., receptores acoplados a proteínas G [GPCR] ) ^{[ 22 ]} y las proteínas multisubunitarias ( p. ej., canales iónicos ), son dianas clave en el descubrimiento de fármacos. La identificación de epítopos en estas dianas puede resultar compleja debido a la dificultad para expresar y purificar estas proteínas complejas. Las proteínas de membrana suelen tener regiones antigénicas cortas (epítopos) que se pliegan correctamente solo en el contexto de una bicapa lipídica. En consecuencia, los epítopos de los anticuerpos monoclonales en estas proteínas de membrana suelen ser conformacionales y, por lo tanto, más difíciles de identificar. ^{[ 15 ] [ 22 ]}

El mapeo de epítopos se ha vuelto predominante en la protección de la propiedad intelectual (PI) de los mAbs terapéuticos. El conocimiento de los sitios de unión específicos de los anticuerpos fortalece las patentes y las presentaciones regulatorias al distinguir entre anticuerpos actuales y de la técnica anterior (existentes). ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 23 ]} La capacidad de diferenciar entre anticuerpos es particularmente importante al patentar anticuerpos contra objetivos terapéuticos bien validados (por ejemplo, PD1 y CD20 ) que pueden ser atacados por múltiples anticuerpos competidores. ^{[ 24 ]} Además de verificar la patentabilidad de los anticuerpos, los datos de mapeo de epítopos se han utilizado para respaldar amplias reivindicaciones de anticuerpos presentadas ante la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos . ^{[ 11 ] [ 12 ]}

Los datos de epítopos han sido fundamentales en varios casos legales de gran repercusión relacionados con disputas sobre las regiones proteicas específicas a las que se dirigen los anticuerpos terapéuticos. ^{[ 23 ]} En este sentido, el caso del inhibidor de PCSK9 de Amgen contra Sanofi / Regeneron Pharmaceuticals se basó en la capacidad de demostrar que tanto los anticuerpos terapéuticos de Amgen como los de Sanofi/Regeneron se unían a aminoácidos superpuestos en la superficie de PCSK9 . ^{[ 25 ]}

Existen varios métodos disponibles para mapear los epítopos de anticuerpos en los antígenos objetivo:

• Cocristalografía de rayos X y microscopía electrónica criogénica (crio-EM) . La cocristalografía de rayos X se ha considerado históricamente como el método de referencia para el mapeo de epítopos, ya que permite la visualización directa de la interacción entre el antígeno y el anticuerpo. La crio-EM puede proporcionar de manera similar mapas de alta resolución de las interacciones anticuerpo-antígeno. ^{[ 26 ]} Sin embargo, ambos métodos son técnicamente complejos, requieren mucho tiempo y son costosos, y no todas las proteínas son aptas para la cristalización. Además, estas técnicas no siempre son factibles debido a la dificultad de obtener cantidades suficientes de proteína correctamente plegada y procesada. Finalmente, ninguna de las técnicas puede distinguir los residuos clave del epítopo (puntos calientes energéticos) ^{[ 27 ]} para los mAbs que se unen al mismo grupo de aminoácidos.
• Escaneo de oligopéptidos basado en matrices . También conocido como escaneo de péptidos superpuestos o análisis pepscan , esta técnica utiliza una biblioteca de secuencias de oligopéptidos de segmentos superpuestos y no superpuestos de una proteína diana, y prueba su capacidad de unirse al anticuerpo de interés. Este método es rápido, relativamente económico y especialmente adecuado para perfilar epítopos para un gran número de anticuerpos candidatos contra una diana definida. ^{[ 21 ] [ 28 ]} La resolución del mapeo de epítopos depende del número de péptidos superpuestos que se utilizan. La principal desventaja de este enfoque es que los epítopos discontinuos se deconstruyen en péptidos más pequeños, lo que puede causar afinidades de unión más bajas. Sin embargo, se han hecho avances con tecnologías como los péptidos restringidos, que se pueden utilizar para imitar epítopos conformacionales así como discontinuos. ^{Por ejemplo, en un estudio [ 29 ]} se mapeóun anticuerpo contra CD20 mediante escaneo de oligopéptidos basado en matrices, combinando secuencias peptídicas no adyacentes de diferentes partes de la proteína diana e imponiendo rigidez conformacional a este péptido combinado (por ejemplo, mediante el uso de andamios CLIPS ^{[ 30 ]} ). El análisis de reemplazo en péptidos también permite la resolución de aminoácidos individuales y, por lo tanto, puede identificar residuos epítopos clave.
• Mapeo mediante mutagénesis dirigida . La técnica de biología molecular de mutagénesis dirigida (SDM) permite el mapeo de epítopos. En la SDM, se introducen mutaciones sistemáticas de aminoácidos en la secuencia de la proteína diana. Se analiza la unión de un anticuerpo a cada proteína mutada para identificar los aminoácidos que componen el epítopo. Esta técnica permite mapear tanto epítopos lineales como conformacionales, pero es laboriosa y requiere mucho tiempo, limitando generalmente el análisis a un número reducido de residuos de aminoácidos. ^{[ 2 ]}
• Mapeo de epítopos por mutagénesis de escopeta de alto rendimiento. ^{[ 2 ] [ 10 ] [ 31 ]} La mutagénesis de escopeta es un enfoque de alto rendimiento para mapear los epítopos de los mAb. ^{[ 31 ]} La técnica de mutagénesis de escopeta comienza con la creación de una biblioteca de mutaciones de todo el antígeno diana , donde cada  clon  contiene una mutación de aminoácido única (típicamente una sustitución de alanina). Cientos de clones de plásmidos de la biblioteca se disponen individualmente en microplacas de 384 pocillos, se expresan en células humanas y se prueban para la unión de anticuerpos. Los aminoácidos de la diana necesarios para la unión del anticuerpo se identifican por una pérdida de inmunorreactividad. Estos residuos se mapean en estructuras de la proteína diana para visualizar el epítopo.  Los beneficios del mapeo de epítopos por mutagénesis de alto rendimiento incluyen: 1) la capacidad de identificar epítopos lineales y conformacionales, 2) un tiempo de ensayo más corto que otros métodos, 3) la presentación de proteínas correctamente plegadas y modificadas postraduccionalmente, y 4) la capacidad de identificar aminoácidos clave que impulsan las interacciones energéticas (puntos calientes energéticos del epítopo). ^{[ 27 ] [ 32 ]} Sin embargo, para epítopos conformacionales donde una gran interfaz está involucrada en la unión, como es el caso de la mayoría de los anticuerpos terapéuticos, la mutación de un residuo no necesariamente resulta en un cambio aparente en la afinidad de unión total. Estos residuos del epítopo pueden pasar desapercibidos con este método.
• Intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX). Este método proporciona información sobre la accesibilidad al solvente de varias partes del antígeno y el anticuerpo, demostrando una accesibilidad reducida al solvente en regiones de interacciones proteína-proteína. ^{[ 33 ]} Una de sus ventajas es que determina el sitio de interacción del complejo antígeno-anticuerpo en su solución nativa, y no introduce ninguna modificación (por ejemplo, mutación) ni al antígeno ni al anticuerpo. El mapeo de epítopos HDX también ha demostrado ser el método eficaz para proporcionar rápidamente información completa sobre la estructura del epítopo. ^{[ 34 ]} El enfoque HDX-MS tradicional de abajo hacia arriba no suele proporcionar datos a nivel de aminoácido, pero esta limitación se ha superado ahora con HDX FineMapping utilizando un enfoque más nuevo de medio hacia abajo. ^{[ 35 ]} El epítopo de unión de Pembrolizumab (Keytruda) en PD1 se determina con éxito mediante este método con resolución de un solo aminoácido ( https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.05.02.592265v1 ), una resolución comparable a la cristalografía de rayos X. Recientemente se ha recomendado como un enfoque de mapeo de epítopos rápido y rentable, ^{[ 36 ]} utilizando el complejo sistema proteico hemaglutinina de la influenza como ejemplo.
• Espectrometría de masas acoplada a reticulación. ^{[ 37 ]} El anticuerpo y el antígeno se unen a un agente de reticulación marcado, y la formación del complejo se confirma mediante detección MALDI de alta masa . La ubicación de unión del anticuerpo al antígeno se puede identificar mediante espectrometría de masas (EM). El complejo reticulado es altamente estable y puede exponerse a diversas condiciones enzimáticas y de digestión, lo que permite muchas opciones diferentes de péptidos para la detección. Se utilizan técnicas de EM o EM/EM para detectar las ubicaciones de aminoácidos de los agentes de reticulación marcados y los péptidos unidos (tanto el epítopo como el paratopo se determinan en un solo experimento). La principal ventaja de esta técnica es la alta sensibilidad de la detección por EM, lo que significa que se necesita muy poco material (cientos de microgramos o menos).

Otros métodos, como la presentación en levadura , la presentación en fagos ^{[ 38 ]} y la proteólisis limitada , proporcionan un monitoreo de alto rendimiento de la unión de anticuerpos, pero carecen de resolución, especialmente para epítopos conformacionales. ^{[ 39 ]}

• Clasificación de epítopos

• Mapeo de epítopos en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.