Microarray de péptidos

Un microarreglo de péptidos (también conocido comúnmente como chip de péptidos o microarreglo de epítopos de péptidos) es una colección de péptidos que se muestran en una superficie sólida, generalmente un chip de vidrio o plástico. Los científicos utilizan chips de péptidos en biología, medicina y farmacología para estudiar las propiedades de unión y la funcionalidad y la cinética de las interacciones proteína-proteína en general. En la investigación básica, los microarreglos de péptidos se utilizan a menudo para perfilar una enzima (como quinasa , fosfatasa , proteasa , acetiltransferasa , histona desacetilasa , etc.), para mapear un epítopo de anticuerpo o para encontrar residuos clave para la unión de proteínas. Las aplicaciones prácticas son el descubrimiento de seromarcadores , el perfil de las respuestas inmunes humorales cambiantes de pacientes individuales durante la progresión de la enfermedad, el seguimiento de intervenciones terapéuticas, la estratificación de pacientes y el desarrollo de herramientas de diagnóstico y vacunas .

El principio de ensayo de los microarrays de péptidos es similar a un protocolo ELISA . Los péptidos (hasta decenas de miles en varias copias) se unen a la superficie de un chip de vidrio que normalmente tiene el tamaño y la forma de un portaobjetos de microscopio. Este chip de péptidos se puede incubar directamente con una variedad de muestras biológicas diferentes, como enzimas o anticuerpos purificados , sueros de pacientes o animales , lisados ​​celulares y luego se puede detectar a través de un método dependiente de la etiqueta, por ejemplo, mediante un anticuerpo primario que se dirige a la proteína unida o sustratos modificados. Después de varios pasos de lavado, se aplica un anticuerpo secundario con la especificidad necesaria (por ejemplo, anti IgG humano/ratón o anti fosfotirosina o anti myc). Por lo general, el anticuerpo secundario se etiqueta con una etiqueta de fluorescencia que se puede detectar mediante un escáner de fluorescencia. ^[2] Otros métodos de detección dependientes de la etiqueta incluyen quimioluminiscencia, colorimetría o autorradiografía.

Los ensayos dependientes de etiquetas son rápidos y convenientes de realizar, pero corren el riesgo de dar lugar a resultados falsos positivos y negativos. ^[3] Más recientemente, la detección sin etiquetas, que incluye espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR), espectrometría de masas (MS) y muchos otros biosensores ópticos ^{[4] [5] [6] [7]} se han empleado para medir una amplia gama de actividades enzimáticas. ^[8]

Los microarrays de péptidos muestran varias ventajas sobre los microarrays de proteínas :

• Facilidad y coste de síntesis
• Estabilidad de almacenamiento prolongada
• Detección de eventos de unión a nivel de epítopo, lo que permite el estudio de la propagación del epítopo.
• Diseño flexible para secuencias de péptidos (es decir, modificaciones postraduccionales, diversidad de secuencias, aminoácidos no naturales...) y químicas de inmovilización.
• Mayor reproducibilidad de lote a lote

Un microarray de péptidos es una lámina plana con péptidos colocados sobre ella o ensamblados directamente sobre la superficie mediante síntesis in situ. Mientras que los péptidos colocados pueden someterse a controles de calidad que incluyen análisis con espectrómetro de masas y normalización de la concentración antes de la colocación y son el resultado de un único lote sintético, los péptidos sintetizados directamente sobre la superficie pueden sufrir variaciones de lote a lote y opciones de control de calidad limitadas. Sin embargo, la síntesis de péptidos en chip permite la síntesis paralela de decenas de miles de péptidos, lo que proporciona bibliotecas de péptidos más grandes junto con menores costos de síntesis. ^[9] Los péptidos se unen idealmente de forma covalente a través de un enlace quimioselectivo que conduce a péptidos con la misma orientación para el perfil de interacción. Algunos procedimientos alternativos describen la unión covalente inespecífica y la inmovilización adhesiva.

Sin embargo, se pueden utilizar métodos litográficos para superar el problema del número excesivo de ciclos de acoplamiento. Se ha descrito la síntesis combinatoria de matrices de péptidos en un microchip mediante impresión láser ^{[9] [10]} , donde se utiliza una impresora láser a color modificada en combinación con la química convencional de síntesis de péptidos en fase sólida ^[11] . Los aminoácidos se inmovilizan dentro de partículas de tóner y los péptidos se imprimen en la superficie del chip en capas combinatorias consecutivas. La fusión del tóner al inicio de la reacción de acoplamiento garantiza que la administración de los aminoácidos y la reacción de acoplamiento se puedan realizar de forma independiente. Otra ventaja de este método es que cada aminoácido se puede producir y purificar por separado, seguido de su incorporación en las partículas de tóner, lo que permite el almacenamiento a largo plazo.

Los microarrays de péptidos se pueden utilizar para estudiar diferentes tipos de interacciones proteína-proteína, especialmente aquellas que involucran subestructuras proteicas modulares llamadas módulos de reconocimiento de péptidos o, más comúnmente, dominios de interacción proteica. La razón de esto es que dichas subestructuras proteicas reconocen motivos lineales cortos a menudo expuestos en regiones nativamente no estructuradas del socio de unión, de modo que la interacción se puede modelar in vitro mediante péptidos como sondas y el módulo de reconocimiento de péptidos como analito. La mayoría de las publicaciones se pueden encontrar en el contexto de monitoreo inmunológico y perfilamiento enzimático.

• Mapeo de regiones inmunodominantes en antígenos o proteomas completos ^{[12] [13] [14] [15]}
• Descubrimiento de seromarcadores ^{[16] [17]}
• Seguimiento de ensayos clínicos ^[18]
• Perfiles de firmas de anticuerpos ^{[19] [20]} y mapeo de epítopos
• Encontrar anticuerpos neutralizantes ^[21]

• Identificación de sustratos para enzimas huérfanas ^[22]
• Optimización de sustratos enzimáticos conocidos ^[23]
• Elucidación de las vías de transducción de señales ^[24]
• Detección de actividades enzimáticas contaminantes
• Secuencia de consenso y determinación de residuos clave ^[25]
• Identificación de sitios de interacción proteína-proteína dentro de un complejo ^[26]

El análisis de datos y la evaluación de los resultados es la parte más importante de cada experimento de microarray. ^[27] Después de escanear las láminas de microarray, el escáner registra una imagen numérica de 20 bits, 16 bits u 8 bits en formato de archivo de imagen etiquetada (*.tif). La imagen .tif permite la interpretación y cuantificación de cada punto fluorescente en la lámina de microarray escaneada. Estos datos cuantitativos son la base para realizar un análisis estadístico sobre los eventos de unión medidos o las modificaciones de péptidos en la lámina de microarray. Para la evaluación e interpretación de las señales detectadas, se debe realizar una asignación del punto de péptido (visible en la imagen) y la secuencia de péptidos correspondiente. Los datos para la asignación generalmente se guardan en el archivo GenePix Array List (.gal) y se suministran junto con el microarray de péptidos. El archivo .gal (un archivo de texto separado por tabuladores) se puede abrir utilizando módulos de software de cuantificación de microarrays o procesarse con un editor de texto (por ejemplo, el bloc de notas) o Microsoft Excel. Este archivo "gal" generalmente lo proporciona el fabricante del microarray y lo generan los archivos txt de entrada y el software de seguimiento integrado en los robots que realizan la fabricación del microarray.