Sistema limitado por difracción

La observación de estructuras por debajo de la longitud de onda con microscopios es difícil debido al límite de difracción de Abbe . Ernst Abbe mencionó por primera vez el límite de difracción en su artículo de 1873, página 466: "[...] die physikalische Unterscheidungsgrenze [...] hängt allein vom Oeffnungswinkel ab und ist dem Sinus seines halben Betrages proporcional", o "[...] el límite físico de resolución [...] depende únicamente del ángulo de apertura y es proporcional al seno de la mitad de su magnitud". ^{[ 2 ]} Abbe lo escribió en forma de fórmula en su artículo de 1882, página 461: "Las dimensiones más pequeñas que están al alcance de una apertura dada se indican con suficiente precisión tomando el límite del poder de resolución o separación de esa apertura para estructuras periódicas o regulares, es decir, la distancia mínima entre elementos dados que pueden delinearse por separado con la apertura en cuestión. La expresión numérica de esa distancia mínima es" ^{[ 3 ]}

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2n\sin \theta }}={\frac {\lambda }{2\mathrm {NA} }}}$,

dónde${\displaystyle \lambda }$es la longitud de onda,${\displaystyle n}$es el índice de refracción del medio, y${\displaystyle \theta }$es el semiángulo de la luz enfocada por el sistema óptico. La misma fórmula fue demostrada por Hermann von Helmholtz en 1874. ^{[ 4 ]} La porción del denominador${\displaystyle n\sin \theta }$se denomina apertura numérica (AN) y puede alcanzar aproximadamente 1,4–1,6 en la óptica moderna, por lo tanto, el límite de Abbe es${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2.8}}}$.

Considerando la luz verde alrededor de 500  nm y una NA de 1, el límite de Abbe es aproximadamente${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2}}=250{\text{ nm}}}$(0,25 μm), un tamaño pequeño en comparación con la mayoría de las células biológicas (de 1 μm a 100 μm), pero grande en comparación con los virus (100  nm), las proteínas (10  nm) y las moléculas menos complejas (1  nm). Para aumentar la resolución, se pueden utilizar longitudes de onda más cortas, como las de los microscopios UV y de rayos X. Estas técnicas ofrecen una mejor resolución, pero son costosas, presentan falta de contraste en muestras biológicas y pueden dañar la muestra.

En una cámara digital, los efectos de difracción interactúan con los efectos de la cuadrícula de píxeles regular. El efecto combinado de las diferentes partes de un sistema óptico está determinado por la convolución de las funciones de dispersión de punto (PSF). La función de dispersión de punto de una lente de apertura circular limitada por difracción es simplemente el disco de Airy . La función de dispersión de punto de la cámara, también llamada función de respuesta del instrumento (IRF), puede aproximarse mediante una función rectangular, con un ancho equivalente al paso de píxel. Fliegel proporciona una derivación más completa de la función de transferencia de modulación (derivada de la PSF) de los sensores de imagen. ^{[ 5 ]} Cualquiera que sea la función de respuesta del instrumento exacta, es en gran medida independiente del número f de la lente. Por lo tanto, para diferentes números f, una cámara puede operar en tres regímenes diferentes, como se indica a continuación:

1. En el caso en que la dispersión de la IRF sea pequeña con respecto a la dispersión de la PSF de difracción, en cuyo caso se puede decir que el sistema está esencialmente limitado por difracción (siempre que la lente en sí esté limitada por difracción).
2. En el caso en que la dispersión de la PSF de difracción sea pequeña con respecto a la IRF, en cuyo caso el sistema está limitado por el instrumento.
3. En el caso de que la dispersión de la PSF y la IRF sean similares, en cuyo caso ambas afectan la resolución disponible del sistema.

La dispersión de la PSF limitada por difracción se aproxima mediante el diámetro del primer nulo del disco de Airy ,

${\displaystyle d/2=1.22\lambda N,\,}$^{[ 6 ]}

dónde${\displaystyle \lambda }$es la longitud de onda de la luz y${\displaystyle N}$es el número f de la óptica de imagen, es decir,${\displaystyle 2\mathrm {NA} \rightarrow (2.44N)^{-1}}$en la fórmula del límite de difracción de Abbe. Por ejemplo, para una lente f/8 (${\displaystyle N=8}$y${\displaystyle \mathrm {NA} \aproximadamente 2,5\%}$) y para luz verde (${\displaystyle \lambda _{g}=}$luz de longitud de onda de 0,5  μm, el diámetro del punto de enfoque será d = 9,76  μm o 19,5${\displaystyle \lambda _{g}}$Esto es similar al tamaño de píxel de la mayoría de las cámaras de "fotograma completo" (sensor diagonal de 43 mm) disponibles comercialmente, por lo que funcionarán en el régimen 3 para números f cercanos a 8 (pocos objetivos están cerca del límite de difracción en números f menores que 8).

Las cámaras con sensores más pequeños tienden a tener píxeles más pequeños, pero sus lentes están diseñadas para usarse con números f más pequeños y es probable que también operen en el régimen 3 para aquellos números f para los que sus lentes están limitados por la difracción. Dado el mismo campo de visión, número de píxeles, velocidad de obturación y relación señal /ruido (es decir, la misma cantidad de luz captada por píxel), un sensor pequeño y uno grande de calidad equivalente producirán la misma imagen digital, con la misma cantidad de desenfoque debido tanto a la difracción como a la profundidad de campo . ^{[ 7 ]} Los sensores más grandes tienen la ventaja de que las lentes para ellos tienden a tener pupilas de entrada máximas más grandes , lo que permite, en mayor medida, intercambiar profundidad de campo por menos desenfoque por difracción y mayor relación señal/ruido o velocidades de obturación más altas. ^{[ 8 ]}

La resolución efectiva de un microscopio se puede mejorar iluminándolo desde un lateral.

En microscopios convencionales como los de campo claro o de contraste de interferencia diferencial , esto se logra mediante el uso de un condensador. En condiciones espacialmente incoherentes, la imagen se entiende como una composición de imágenes iluminadas desde cada punto del condensador, cada una de las cuales cubre una porción diferente de las frecuencias espaciales del objeto. ^{[ 12 ]} Esto mejora la resolución, como máximo, en un factor de dos.

La iluminación simultánea desde todos los ángulos (condensador completamente abierto) reduce el contraste interferométrico. En los microscopios convencionales, la resolución máxima (condensador completamente abierto, a N  =  1) rara vez se utiliza. Además, en condiciones parcialmente coherentes, la imagen registrada suele ser no lineal con el potencial de dispersión del objeto, especialmente al observar objetos no autoluminosos (no fluorescentes). ^{[ 13 ]} Para aumentar el contraste, y a veces para linealizar el sistema, los microscopios no convencionales (con iluminación estructurada ) sintetizan la iluminación del condensador adquiriendo una secuencia de imágenes con parámetros de iluminación conocidos. Normalmente, estas imágenes se componen para formar una sola imagen con datos que cubren una porción mayor de las frecuencias espaciales del objeto en comparación con el uso de un condensador completamente cerrado (que también se utiliza raramente).

Otra técnica, la microscopía 4Pi , utiliza dos objetivos opuestos para duplicar la apertura numérica efectiva, reduciendo a la mitad el límite de difracción, mediante la captación de la luz dispersada hacia adelante y hacia atrás. Al obtener imágenes de una muestra transparente, con una combinación de iluminación incoherente o estructurada, y captando tanto la luz dispersada hacia adelante como hacia atrás, es posible visualizar la esfera de dispersión completa .

A diferencia de los métodos que se basan en la localización , estos sistemas aún están limitados por el límite de difracción de la iluminación (condensador) y la óptica de recolección (objetivo), aunque en la práctica pueden proporcionar mejoras sustanciales en la resolución en comparación con los métodos convencionales.

El límite de difracción solo es válido en el campo lejano, ya que supone que ningún campo evanescente llega al detector. Diversas técnicas de campo cercano , que operan a menos de ≈1 longitud de onda de luz del plano de imagen, permiten obtener una resolución sustancialmente mayor. Estas técnicas aprovechan el hecho de que el campo evanescente contiene información más allá del límite de difracción, la cual puede utilizarse para construir imágenes de muy alta resolución, superando en principio el límite de difracción por un factor proporcional a la capacidad del sistema de imagen específico para detectar la señal de campo cercano. Para la obtención de imágenes de luz dispersa, se pueden utilizar instrumentos como microscopios ópticos de barrido de campo cercano y nano-FTIR , que se construyen sobre sistemas de microscopía de fuerza atómica , para alcanzar una resolución de hasta 10-50  nm. Los datos registrados por estos instrumentos suelen requerir un procesamiento considerable, que consiste esencialmente en resolver un problema inverso óptico para cada imagen.

Las superlentes basadas en metamateriales pueden obtener imágenes con una resolución mejor que el límite de difracción al colocar la lente objetivo extremadamente cerca (normalmente a cientos de nanómetros) del objeto.

En la microscopía de fluorescencia, la excitación y la emisión suelen producirse en longitudes de onda diferentes. En la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, una fina porción de la muestra, situada directamente sobre el cubreobjetos, se excita con un campo evanescente y se registra con un objetivo convencional limitado por difracción, lo que mejora la resolución axial.

Sin embargo, debido a que estas técnicas no pueden obtener imágenes más allá de 1 longitud de onda, no se pueden utilizar para obtener imágenes de objetos más gruesos que 1 longitud de onda, lo que limita su aplicabilidad.

Las técnicas de imagen de campo lejano son las más adecuadas para visualizar objetos de gran tamaño en comparación con la longitud de onda de iluminación, pero que presentan una estructura fina. Esto incluye prácticamente todas las aplicaciones biológicas, en las que las células abarcan múltiples longitudes de onda, pero contienen estructuras a escala molecular. En los últimos años, diversas técnicas han demostrado que es posible obtener imágenes con resolución inferior al límite de difracción a distancias macroscópicas. Estas técnicas suelen aprovechar la no linealidad óptica de la luz reflejada por un material para generar una resolución superior al límite de difracción.

Entre estas técnicas, el microscopio STED ha sido uno de los más exitosos. En STED, se utilizan múltiples haces láser para excitar y luego atenuar los colorantes fluorescentes . La respuesta no lineal a la iluminación causada por el proceso de atenuación, en el que al añadir más luz la imagen se vuelve menos brillante, genera información subdifractiva sobre la ubicación de las moléculas del colorante, lo que permite una resolución muy superior al límite de difracción siempre que se utilicen altas intensidades de iluminación.