Microscopía de campo oscuro

Los pasos se ilustran en la figura donde se utiliza un microscopio invertido .

1. La luz entra en el microscopio para iluminar la muestra.
2. Un disco de tamaño especial, el diafragma (véase la figura), bloquea parte de la luz procedente de la fuente luminosa, dejando un anillo exterior iluminado. También se puede sustituir por un anillo de fase ancho a baja magnificación.
3. La lente condensadora enfoca la luz hacia la muestra.
4. La luz entra en la muestra. La mayor parte se transmite directamente, mientras que una parte se dispersa al interactuar con la muestra.
5. La luz dispersa entra en la lente del objetivo, mientras que la luz transmitida directamente simplemente no llega a la lente y no se recoge debido a un bloqueador de iluminación directa (véase la figura).
6. Solo la luz dispersada participa en la formación de la imagen, mientras que la luz transmitida directamente se omite.

La microscopía de campo oscuro es una técnica muy simple pero eficaz, idónea para su uso con muestras biológicas vivas y sin teñir , como frotis de cultivos celulares u organismos unicelulares individuales presentes en el agua. ^{[ 4 ]} Dada la simplicidad de la configuración, la calidad de las imágenes obtenidas con esta técnica es impresionante.

Una limitación de la microscopía de campo oscuro son los bajos niveles de luz que se observan en la imagen final. Esto significa que la muestra debe estar muy intensamente iluminada, lo que puede dañarla.

Las técnicas de microscopía de campo oscuro están prácticamente libres de los artefactos de halo o relieve típicos de la microscopía de contraste de interferencia diferencial . Esto se consigue a costa de una menor sensibilidad a la información de fase.

La interpretación de las imágenes de campo oscuro debe realizarse con sumo cuidado, ya que las características oscuras comunes en las imágenes de microscopía de campo claro pueden ser invisibles, y viceversa. En general, la imagen de campo oscuro carece de las bajas frecuencias espaciales asociadas a la imagen de campo claro, lo que la convierte en una versión con paso alto de la estructura subyacente.

Si bien la imagen de campo oscuro puede parecer inicialmente un negativo de la imagen de campo claro, en cada una se aprecian efectos diferentes. En la microscopía de campo claro, se observan detalles donde la luz incidente proyecta una sombra sobre la superficie o donde una parte de la superficie es menos reflectante, posiblemente debido a la presencia de hoyos o arañazos. Los relieves demasiado lisos para proyectar sombras no aparecerán en las imágenes de campo claro, pero la luz que se refleja en los laterales del relieve será visible en las imágenes de campo oscuro.

• Comparación de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú (1,559 μm/píxel cuando se observa a resolución completa).
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  Iluminación de campo oscuro, el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.
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  Iluminación de campo claro , el contraste de la muestra proviene de la atenuación de la luz en la muestra.
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  Iluminación con luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.
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  Iluminación por contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de la luz a través de la muestra.

La microscopía de campo oscuro se ha aplicado en los dispositivos señaladores de los ratones de ordenador para permitir que el ratón funcione sobre vidrio transparente mediante la obtención de imágenes de defectos microscópicos y polvo en la superficie del vidrio.

En resumen, la obtención de imágenes ^{[ 5 ]} implica inclinar la iluminación incidente hasta que un haz difractado, en lugar del incidente, atraviese una pequeña apertura del objetivo en el plano focal posterior de la lente. Las imágenes de campo oscuro, bajo estas condiciones, permiten mapear la intensidad difractada proveniente de un único conjunto de planos de difracción en función de la posición proyectada sobre la muestra y en función de la inclinación de la misma.

En muestras monocristalinas, las imágenes de campo oscuro de reflexión única de una muestra ligeramente inclinada respecto a la condición de Bragg permiten visualizar únicamente aquellos defectos de la red, como dislocaciones o precipitados, que deforman un conjunto específico de planos reticulares en su entorno. El análisis de las intensidades en dichas imágenes puede utilizarse para estimar la magnitud de esa deformación. En cambio, en muestras policristalinas, las imágenes de campo oscuro solo permiten visualizar el subconjunto de cristales que presentan reflexión de Bragg en una orientación determinada.

La microscopía de haz débil utiliza una óptica similar a la del campo oscuro convencional, pero emplea un armónico del haz difractado en lugar del haz difractado en sí. De esta forma, se puede obtener una resolución mucho mayor de las regiones deformadas alrededor de los defectos.

La microscopía de campo oscuro anular requiere la formación de imágenes mediante electrones difractados en una apertura anular centrada en el haz no dispersado, pero sin incluirlo. Para ángulos de dispersión grandes en un microscopio electrónico de transmisión de barrido , esto a veces se denomina imagen de contraste Z debido a la mayor dispersión producida por átomos de alto número atómico.

Esta es una técnica matemática intermedia entre el espacio directo y el recíproco (transformada de Fourier) para explorar imágenes con periodicidades bien definidas, como las imágenes de franjas reticulares en un microscopio electrónico. Al igual que con la microscopía de campo oscuro analógica en un microscopio electrónico de transmisión, permite "iluminar" aquellos objetos en el campo de visión donde residen las periodicidades de interés. A diferencia de la microscopía de campo oscuro analógica, también puede permitir mapear la fase de Fourier de las periodicidades y, por lo tanto, los gradientes de fase, que proporcionan información cuantitativa sobre la deformación vectorial de la red.