Sonda de hibridación

En biología molecular , una sonda de hibridación ( HP ) es un fragmento de ADN o ARN , generalmente de 15 a 10 000 nucleótidos de longitud, que puede marcarse radiactivamente o con fluorescencia . Las HP se pueden utilizar para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos en el ARN o ADN analizado que sean complementarias a la secuencia de la sonda. ^[1] La sonda marcada primero se desnaturaliza (mediante calentamiento o en condiciones alcalinas , como la exposición al hidróxido de sodio ) en ADN monocatenario (ssDNA) y luego se hibrida con el ssDNA objetivo ( transferencia Southern ) o ARN ( transferencia Northern ) inmovilizado en una membrana o in situ .

Para detectar la hibridación de la sonda con su secuencia objetivo, la sonda se etiqueta (o "marca") con un marcador molecular de moléculas radiactivas o (más recientemente) fluorescentes. Los marcadores comúnmente utilizados son ³² P (un isótopo radiactivo del fósforo incorporado al enlace fosfodiéster en el ADN de la sonda), digoxigenina , un marcador no radiactivo basado en anticuerpos , biotina o fluoresceína. Las secuencias de ADN o las transcripciones de ARN que tienen una similitud de secuencia moderada a alta con la sonda se detectan luego visualizando la sonda hibridada mediante autorradiografía u otras técnicas de imagen. Normalmente, se toman imágenes de rayos X del filtro o el filtro se coloca bajo luz ultravioleta. La detección de secuencias con una similitud moderada o alta depende de qué tan estrictas se aplicaron las condiciones de hibridación: una rigurosidad alta, como una temperatura de hibridación alta y una sal baja en los tampones de hibridación, solo permite la hibridación entre secuencias de ácidos nucleicos que son muy similares, mientras que una rigurosidad baja, como una temperatura más baja y una sal alta, permite la hibridación cuando las secuencias son menos similares.

Las sondas de hibridación utilizadas en microarrays de ADN se refieren al ADN unido covalentemente a una superficie inerte, como portaobjetos de vidrio recubiertos o chips genéticos , a la que se hibrida un objetivo de ADNc móvil . Dependiendo del método , la sonda puede sintetizarse utilizando el método de fosforamidita , o puede generarse y marcarse mediante amplificación por PCR o clonación (ambos son métodos más antiguos). Para aumentar la estabilidad in vivo de la sonda, no se utiliza ARN. En su lugar, se pueden utilizar análogos de ARN , en particular derivados de morfolino . Las sondas basadas en ADN molecular o ARN se utilizan rutinariamente en el cribado de bibliotecas de genes, la detección de secuencias de nucleótidos con métodos de transferencia y en otras tecnologías genéticas, como los microarrays de ácidos nucleicos y tejidos .

• Sondas Scorpion®
• Sondas de baliza molecular
• Sondas TaqMan ®
• Sondas LNA® ( ácido nucleico bloqueado )
• Tecnología de sonda cíclica (CPT)

En el campo de la ecología microbiana , las sondas de oligonucleótidos se utilizan para determinar la presencia de especies, géneros o microorganismos microbianos clasificados en un nivel más amplio, como bacterias , arqueas y eucariotas mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH). ^[2] Las sondas de ARNr han permitido a los científicos visualizar microorganismos, aún no cultivados en entornos de laboratorio, mediante la recuperación de secuencias de ARNr directamente del entorno. ^[3] Algunos ejemplos de estos tipos de microorganismos incluyen:

• Nevskia ramosa : N. ramosa es una bacteria de Neuston que forma rosetas típicas, ramificadas dicotómicamente, en la superficie de hábitats de agua dulce poco profundos. ^[4]
• Achromatium oxaliferum : esta bacteria enorme (longitud celular de hasta >100 μm, diámetro de hasta 50 μm) contiene glóbulos de azufre e inclusiones masivas de calcita y habita las capas superiores de sedimentos de agua dulce. Es visible a simple vista y, por su resistencia al cultivo, ha desconcertado a generaciones de microbiólogos. ^[5]

En algunos casos, la diferenciación entre especies puede ser problemática cuando se utilizan secuencias de ARNr 16S debido a la similitud. En tales casos, el ARNr 23S puede ser una mejor alternativa. ^[6] La biblioteca estándar global de secuencias de ARNr se hace cada vez más grande y se actualiza continuamente, y por lo tanto, la posibilidad de un evento de hibridación aleatorio entre una sonda diseñada específicamente (basada en datos completos y actuales de una variedad de organismos de prueba) y un organismo objetivo no deseado/desconocido no se puede descartar fácilmente. ^[7] Por el contrario, es plausible que existan microorganismos, aún por identificar, que sean miembros filogenéticamente de un grupo objetivo de la sonda, pero que tengan sitios objetivo parciales o casi perfectos, lo que generalmente se aplica al diseñar sondas específicas del grupo.

Probablemente la mayor limitación práctica de esta técnica es la falta de automatización disponible. ^[8]

En la ciencia forense, las sondas de hibridación se utilizan, por ejemplo, para la detección de regiones de repeticiones cortas en tándem ( microsatélites ) ^[9] y en métodos de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ( RFLP ), todos los cuales se utilizan ampliamente como parte del análisis de perfiles de ADN .

• Sonda molecular