dihidrofolato reductasa

La DHFR cataliza la transferencia de un hidruro del NADPH al dihidrofolato con una protonación concomitante para producir tetrahidrofolato . ^{[ 11 ]} Finalmente, el dihidrofolato se reduce a tetrahidrofolato y el NADPH se oxida a NADP+ . La alta flexibilidad de Met20 y otros bucles cerca del sitio activo desempeñan un papel en la promoción de la liberación del producto, el tetrahidrofolato. En particular, el bucle Met20 ayuda a estabilizar el anillo de nicotinamida del NADPH para promover la transferencia del hidruro del NADPH al dihidrofolato. ^{[ 17 ]}

El mecanismo de esta enzima es aleatorio, por etapas y en estado estacionario. Específicamente, la reacción catalítica comienza con la unión del NADPH y el sustrato al sitio de unión de la enzima, seguida de la protonación y la transferencia de hidruro del cofactor NADPH al sustrato. Sin embargo, estos dos últimos pasos no ocurren simultáneamente en un mismo estado de transición. ^{[ 18 ] [ 19 ]} En un estudio que utiliza enfoques computacionales y experimentales, Liu et al. concluyen que el paso de protonación precede a la transferencia de hidruro. ^{[ 20 ]}

Se ha demostrado que el mecanismo enzimático de la DHFR depende del pH, en particular el paso de transferencia de hidruro, ya que se ha demostrado que los cambios de pH tienen una influencia notable en la electrostática del sitio activo y el estado de ionización de sus residuos. ^{[ 20 ]} La acidez del nitrógeno objetivo en el sustrato es importante en la unión del sustrato al sitio de unión de la enzima, que se ha demostrado que es hidrofóbico a pesar de tener contacto directo con el agua. ^{[ 18 ] [ 21 ]} Asp27 es el único residuo hidrofílico cargado en el sitio de unión, y la neutralización de la carga en Asp27 puede alterar el pKa de la enzima. Asp27 juega un papel crítico en el mecanismo catalítico al ayudar con la protonación del sustrato y restringir el sustrato en la conformación favorable para la transferencia de hidruro. ^{[ 22 ] [ 18 ] [ 21 ]} Se ha demostrado que el paso de protonación está asociado con la tautomerización enólica a pesar de que esta conversión no se considera favorable para la donación de protones. ^{[ 19 ]} Se ha demostrado que una molécula de agua participa en la etapa de protonación. ^{[ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]} La entrada de la molécula de agua al sitio activo de la enzima se facilita mediante el bucle Met20. ^{[ 26 ]}

El ciclo catalítico de la reacción catalizada por DHFR incorpora cinco intermediarios importantes: holoenzima (E:NADPH), complejo de Michaelis (E:NADPH:DHF), complejo de producto ternario (E:NADP ⁺ :THF), complejo binario de tetrahidrofolato (E:THF) y complejo THF‚NADPH (E:NADPH:THF). La disociación del producto (THF) de E:NADPH:THF a E:NADPH es la etapa determinante de la velocidad durante el ciclo catalítico en estado estacionario. ^{[ 22 ]}

Los cambios conformacionales son críticos en el mecanismo catalítico de la DHFR. ^{[ 27 ]} El bucle Met20 de la DHFR puede abrir, cerrar u ocluir el sitio activo. ^{[ 24 ] [ 18 ]} Correspondientemente, se asignan tres conformaciones diferentes clasificadas como estados abierto, cerrado y ocluido a Met20. Además, se definió una conformación distorsionada adicional de Met20 debido a sus resultados de caracterización poco claros. ^{[ 24 ]} El bucle Met20 se observa en su conformación ocluida en los tres intermedios de ligación del producto, donde el anillo de nicotinamida está ocluido del sitio activo. Esta característica conformacional explica el hecho de que la sustitución de NADP ⁺ por NADPH es anterior a la disociación del producto. Por lo tanto, la siguiente ronda de reacción puede ocurrir tras la unión del sustrato. ^{[ 22 ]}

Debido a su estructura única y características catalíticas, la DHFR R67 es ampliamente estudiada. La DHFR R67 es una DHFR codificada por un plásmido R de tipo II sin relación genética ni estructural con la DHFR cromosómica de E. coli. Es un homotetrámero que posee simetría 222 con un único poro del sitio activo expuesto al disolvente. ^{[ 28 ]} Esta simetría del sitio activo da como resultado un modo de unión diferente para la enzima: puede unirse a dos moléculas de dihidrofolato (DHF) con cooperatividad positiva o a dos moléculas de NADPH con cooperatividad negativa, o a un sustrato más uno, pero solo este último tiene actividad catalítica. ^{[ 29 ]} En comparación con la DHFR cromosómica de E. coli, tiene una K _m más alta en la unión de dihidrofolato (DHF) y NADPH. La cinética catalítica mucho menor muestra que la transferencia de hidruro es la etapa determinante de la velocidad en lugar de la liberación del producto (THF). ^{[ 30 ]}

En la estructura de la DHFR R67, el homotetrámero forma un poro en el sitio activo. En el proceso catalítico, el DHF y el NADPH entran en el poro desde posiciones opuestas. La interacción de apilamiento π-π entre el anillo de nicotinamida del NADPH y el anillo de pteridina del DHF conecta firmemente ambos reactivos en el sitio activo. Sin embargo, se observó flexibilidad en la cola de p-aminobenzoilglutamato del DHF tras la unión, lo que puede promover la formación del estado de transición . ^{[ 31 ]}

• 
  Comparación de la cinética de reacción entre la DHFR de E. coli (EcDHFR) y la DHFR R67.
• 
  Diferencia estructural de la unión del sustrato en EcDHFR y R67 DHFR

La DHFR es responsable de los niveles de tetrahidrofolato en una célula, y la inhibición de la DHFR puede limitar el crecimiento y la proliferación de células características del cáncer y las infecciones bacterianas. El metotrexato , un inhibidor competitivo de la DHFR, es uno de estos fármacos anticancerígenos que inhibe la DHFR. ^{[ 35 ]}

El folato es esencial para el crecimiento, ^{[ 36 ]} y la vía metabólica del folato constituye un objetivo para el desarrollo de tratamientos contra el cáncer. La DHFR es uno de estos objetivos. Se ha demostrado que un régimen de fluorouracilo , doxorrubicina y metotrexato prolonga la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico avanzado. ^{[ 37 ]} Futuros estudios sobre los inhibidores de la DHFR podrían conducir a nuevas formas de tratar el cáncer.

Las bacterias también necesitan DHFR para crecer y multiplicarse, por lo que los inhibidores selectivos de DHFR bacteriana se han utilizado como agentes antibacterianos. ^{[ 38 ]} El trimetoprim ha demostrado actividad contra diversos patógenos bacterianos Grampositivos . ^{[ 38 ]} Sin embargo, la resistencia al trimetoprim y otros fármacos dirigidos a la DHFR puede surgir debido a diversos mecanismos, lo que limita el éxito de sus usos terapéuticos. ^{[ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]} La resistencia puede surgir por amplificación del gen DHFR, mutaciones en DHFR, ^{[ 42 ] [ 43 ]} disminución en la absorción de los fármacos, entre otros. No obstante, la combinación de trimetoprim y sulfametoxazol se ha utilizado como agente antibacteriano durante décadas. ^{[ 38 ]}

La pirimetamina es un agente antiprotozoario ampliamente utilizado . ^{[ 44 ]}

Otras clases de compuestos que actúan sobre la DHFR en general, y sobre las DHFR bacterianas en particular, pertenecen a clases como las diaminopteridinas, las diaminotriazinas, las diaminopirroloquinazolinas, los estilbenos, las chalconas, las desoxibenzoínas, las diaminoquinazolinas, las diaminopirroloquinazolinas, por nombrar solo algunas.

Tratamiento potencial contra el ántrax

La dihidrofolato reductasa de Bacillus anthracis (BaDHFR) es una diana farmacológica validada para el tratamiento del ántrax, una enfermedad infecciosa. La BaDHFR es menos sensible a los análogos de trimetoprima que la dihidrofolato reductasa de otras especies, como Escherichia coli , Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae . Un análisis estructural de la dihidrofolato reductasa de las cuatro especies muestra que solo la BaDHFR presenta la combinación de fenilalanina y tirosina en las posiciones 96 y 102, respectivamente.

La resistencia de BaDHFR a los análogos de trimetoprima se debe a estos dos residuos (F96 y Y102), que también confieren una cinética y una eficiencia catalítica mejoradas. ^{[ 45 ]} La investigación actual utiliza mutantes del sitio activo en BaDHFR para guiar la optimización de compuestos líderes para nuevos inhibidores antifolato. ^{[ 45 ]}