Proceso de Cohn

El proceso Cohn , desarrollado por Edwin J. Cohn , es una serie de pasos de purificación cuyo propósito es extraer albúmina del plasma sanguíneo . El proceso se basa en la solubilidad diferencial de la albúmina y otras proteínas plasmáticas según el pH , la concentración de etanol , la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de proteínas. ^{[ 1 ] [ 2 ]} La albúmina tiene la mayor solubilidad y el punto isoeléctrico más bajo de todas las principales proteínas plasmáticas. Esto la convierte en el producto final que se precipita, es decir, se separa de su solución en forma sólida. La albúmina fue un excelente sustituto del plasma humano en la Segunda Guerra Mundial. Cuando se administraba a soldados heridos u otros pacientes con pérdida de sangre, ayudaba a expandir el volumen sanguíneo y conducía a una recuperación más rápida. El método de Cohn era lo suficientemente suave como para que la proteína de albúmina aislada conservara su actividad biológica . ^{[ 3 ]}

Durante las operaciones, la concentración de etanol cambia de cero inicialmente al 40%. El pH disminuye de neutro (7) a más ácido (4,8) a lo largo del proceso de fraccionamiento. La temperatura comienza a temperatura ambiente y disminuye hasta -5 grados Celsius. Inicialmente, la sangre está congelada. Hay cinco fracciones principales. Cada fracción termina con un precipitado específico. Estos precipitados son las fracciones individuales. ^{[ 4 ]}

Las fracciones I, II y III se precipitan en etapas tempranas. Las condiciones de las etapas tempranas son 8% de etanol, pH 7.2, −3  °C y 5.1% de proteína para la fracción I; 25% de etanol, pH 6.9, −5  °C y 3% de proteína. La albúmina permanece en la fracción sobrenadante durante la separación sólido/líquido bajo estas condiciones. La fracción IV contiene varias proteínas no deseadas que deben eliminarse. Para ello, se varían las condiciones para precipitar las proteínas. Las condiciones para precipitar estas proteínas son aumentar la concentración de etanol del 18% al 40% y aumentar el pH de 5.2 a 5.8. Finalmente, la albúmina se encuentra en la fracción V. La precipitación de la albúmina se realiza reduciendo el pH a 4.8, que está cerca del pI de la proteína, y manteniendo la concentración de etanol al 40%, con una concentración de proteína del 1%. Por lo tanto, solo el 1% del plasma original permanece en la quinta fracción. ^{[ 4 ]}

Sin embargo, se pierde albúmina en cada etapa del proceso, aproximadamente un 20 % durante las etapas de precipitación antes de la fracción V. Para purificar la albúmina, se realiza una extracción con agua y un ajuste a etanol al 10 %, con un pH de 4,5 a −3  °C. Cualquier precipitado que se forme se elimina por filtración y se considera una impureza. Estos precipitados se desechan. La reprecipitación, o repetición de la etapa de precipitación para mejorar la pureza, se realiza aumentando la concentración de etanol al 40 % con respecto a la etapa de extracción. El pH es de 5,2 y se lleva a cabo a −5  °C. Se crearon varias variaciones de la fracción de Cohn para lograr un menor costo y un mayor rendimiento. Generalmente, si el rendimiento es alto, la pureza se reduce a aproximadamente un 85-90 %. ^{[ 4 ]}

Cohn pudo fundar el Laboratorio de Fraccionamiento de Plasma tras recibir una financiación masiva de agencias gubernamentales y compañías farmacéuticas privadas. Esto condujo al fraccionamiento del plasma humano. El plasma humano demostró tener varios componentes útiles además de la albúmina. El fraccionamiento del plasma sanguíneo humano produjo albúmina sérica humana , gammaglobulina sérica , fibrinógeno , trombina y globulinas de grupos sanguíneos. ^{[ 5 ]} Las fracciones de fibrinógeno y trombina se combinaron durante la guerra para crear productos adicionales, como un sellador de fibrina líquido , ^{[ 6 ]} espuma de fibrina sólida y una película de fibrina. ^{[ 7 ]} Las gammaglobulinas se encuentran en las fracciones II y III y demostraron ser esenciales en el tratamiento del sarampión en los soldados. La gammaglobulina también fue útil en el tratamiento de la poliomielitis, pero no tuvo mucho efecto en el tratamiento de las paperas o la escarlatina. Lo más importante es que las gammaglobulinas fueron útiles para modificar y prevenir la hepatitis infecciosa durante la Segunda Guerra Mundial. Finalmente, se convirtió en un tratamiento para los niños expuestos a este tipo de hepatitis. ^{[ 5 ]}

El sellador de fibrina líquido se utilizó en el tratamiento de víctimas de quemaduras, incluidas algunas del ataque a Pearl Harbor, para fijar injertos de piel con una mayor tasa de éxito. ^{[ 6 ]} También se encontró útil para reconectar o anastomosar nervios seccionados. ^{[ 6 ]} La espuma de fibrina y la trombina se utilizaron para controlar el sangrado de los vasos sanguíneos, especialmente en lesiones hepáticas y cerca de tumores. También minimizó el sangrado de venas grandes, así como el tratamiento de malformaciones de los vasos sanguíneos dentro del cerebro. La película de fibrina se utilizó para detener el sangrado en diversas aplicaciones quirúrgicas, incluida la neurocirugía. ^{[ 6 ]} Sin embargo, no fue útil para controlar el sangrado arterial. ^{[ 5 ]} El primer producto a base de fibrinógeno/fibrina capaz de detener la hemorragia arterial fue el "vendaje sellador de fibrina" o "apósito hemostático (HD)", inventado por Martin MacPhee en la Cruz Roja Americana a principios de la década de 1990 y probado en colaboración con el Ejército de los Estados Unidos. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

El método Gerlough, desarrollado en 1955, mejoró la rentabilidad del proceso al reducir el consumo de etanol. En lugar de un 40 % en ciertas etapas, Gerlough utilizó un 20 % de etanol para la precipitación. Esto se aplica especialmente a las fracciones II y III. Además, Gerlough combinó las dos fracciones con la IV en una sola etapa para reducir el número de fraccionamientos necesarios. Si bien este método resultó menos costoso, no fue adoptado por la industria debido a la combinación de las fracciones II, III y IV, por temor a la mezcla y a la alta concentración de impurezas. ^{[ 10 ]}

El método Hink se desarrolló en 1957. Este método proporcionó mayores rendimientos mediante la recuperación de algunas de las proteínas plasmáticas descartadas en las fracciones de IV. Sin embargo, los mejores rendimientos se vieron contrarrestados por las menores purezas obtenidas, dentro del rango del 85 %. ^{[ 10 ]}

El método Mulford, similar al de Hink, utilizaba el sobrenadante de las fracciones II y III como último paso antes del acabado y el tratamiento térmico. El método combinaba las fracciones IV y V, pero en este caso, la albúmina no sería tan pura, aunque los rendimientos podrían ser mayores. ^{[ 10 ]}

Kistler y Nitschmann desarrollaron otra variante para obtener una forma más pura de albúmina, aunque con rendimientos menores. De forma similar a Gerlough, el precipitado A, equivalente a las fracciones II y III de Cohn, se obtuvo con una concentración de etanol del 19%, pero el pH también se redujo a 5,85. Asimismo, de forma similar a Gerlough y Mulford, la fracción IV se combinó y precipitó en condiciones de etanol al 40%, pH de 5,85 y temperatura de -8 °C. La albúmina recuperada en la fracción V se recupera en el precipitado C con un ajuste de pH a 4,8. De forma similar al proceso de Cohn, la albúmina se purifica mediante extracción en agua seguida de la precipitación de las impurezas con etanol al 10%, pH 4,6 y -3 °C. Al igual que en el proceso de Cohn, el precipitado formado se filtra y se desecha. Luego, el precipitado C (fracción V) se vuelve a precipitar a pH 5,2 y se almacena como una pasta a −40 grados C. ^{[ 10 ]} Este proceso ha sido más ampliamente aceptado porque separa las fracciones y hace que cada etapa sea independiente de las demás.

Otra variante implicaba una fracción de etanol por calor. Originalmente se desarrolló para inactivar el virus de la hepatitis. En este proceso, la recuperación de albúmina de alta pureza y alto rendimiento es el objetivo principal, mientras que las demás proteínas plasmáticas se descuidan. Para asegurar que la albúmina no se desnaturalice con el calor, se utilizan estabilizadores como el octanoato de sodio, que le permiten tolerar temperaturas elevadas durante periodos prolongados. En la fracción de etanol por calor, el plasma se trata térmicamente a 68 °C con octanoato de sodio y etanol al 9 % a un pH de 6,5. Esto resulta en una mejor recuperación de albúmina con rendimientos del 90 % y purezas del 100 %. No es tan costoso como los procedimientos con etanol frío, como el Proceso Cohn. Una desventaja es la presencia de nuevos antígenos debido a la posible desnaturalización térmica de la albúmina. Además, las demás proteínas plasmáticas tienen usos prácticos y no valdría la pena descuidarlas. Finalmente, el costo de los recipientes para el tratamiento térmico contrarresta el menor costo en comparación con el formato de etanol frío, que no lo requiere. Por estas razones, varias empresas no han adoptado este método a pesar de que ofrece los resultados más impresionantes. Sin embargo, una organización destacada que lo utiliza es la Cruz Roja Alemana. ^{[ 10 ]}

La última variante fue desarrollada por Hao en 1979. Este método es significativamente más sencillo que el Proceso Cohn. Su objetivo es obtener altos rendimientos de albúmina siempre que esta sea el único producto. Mediante un proceso de dos etapas, las impurezas se precipitan directamente del sobrenadante de las fracciones II y III con etanol al 42%, pH 5,8, temperatura de -5 °C, 1,2% de proteína y fuerza iónica de 0,09. La fracción V se precipita a pH 4,8. Las fracciones I, II, III y IV se coprecipitan con etanol al 40%, pH de 5,4 a 7,0 y temperatura de -3 a -7 °C. La fracción V se precipita a pH 4,8 y -10 °C. Los altos rendimientos se deben a la combinación de un proceso simplificado, con menores pérdidas por coprecipitación, y el uso de filtración. También se lograron purezas más altas, del 98%, debido a los niveles más altos de etanol, pero los rendimientos disminuyeron con la alta pureza. ^{[ 10 ]}

Los métodos más recientes implican el uso de cromatografía . ^{[ 11 ]}

El proceso Cohn representó un avance fundamental en el campo del fraccionamiento sanguíneo . Tiene diversas aplicaciones prácticas en el tratamiento de enfermedades como la hepatitis y la poliomielitis. Fue especialmente útil durante la Segunda Guerra Mundial, donde los soldados se recuperaban más rápidamente gracias a las transfusiones de albúmina. El proceso Cohn se ha modificado a lo largo de los años, como se ha mencionado anteriormente. Además, ha influido en otros procesos de la industria del fraccionamiento sanguíneo, dando lugar a nuevas formas de fraccionamiento, como el fraccionamiento plasmático cromatográfico en los procesos de intercambio iónico y de acabado de albúmina. En general, el proceso Cohn y sus variantes han impulsado enormemente la industria del fraccionamiento y constituyen su base hasta el día de hoy. ^{[ 12 ]}

Sin embargo, el proceso no se ha estudiado bien porque es arcaico. Lo más importante es que nunca ha sido modernizado por las empresas manufactureras. El formato de etanol frío puede ser demasiado suave para eliminar ciertos virus que requieren inactivación por calor. Dado que este proceso permanece sin cambios durante tanto tiempo, varias ineficiencias e inconsistencias inherentes afectan la economía del proceso para las empresas farmacéuticas y manufactureras. ^{[ 12 ]} Una excepción a esto fue la aplicación en Escocia del procesamiento de flujo continuo en lugar del procesamiento por lotes. Este proceso fue diseñado en el Centro de Fraccionamiento de Proteínas (PFC), la instalación de fraccionamiento de plasma del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre de Escocia (SNBTS). Este proceso implicó el monitoreo y control en línea del pH y la temperatura, con control de flujo de corrientes de plasma y etanol utilizando bombas de engranajes de precisión, todo bajo control de retroalimentación computarizado. Como resultado, las fracciones Cohn I+II+III, IV y V se produjeron en unas pocas horas, en lugar de en muchos días. La preparación de flujo continuo de crioprecipitado se integró posteriormente en el proceso aguas arriba del Fraccionamiento Cohn. ^{[ 13 ]}

No obstante, este proceso sigue siendo un pilar fundamental para la industria sanguínea en general, y su influencia se evidencia en el desarrollo de métodos más recientes. Si bien presenta inconvenientes según la variante, la principal ventaja del Proceso Cohn reside en su utilidad práctica y su relevancia en las industrias farmacológica y médica.