Apoptosoma

El apoptosoma es una gran estructura proteica cuaternaria que se forma durante el proceso de apoptosis . Su formación se desencadena por la liberación de citocromo c de las mitocondrias en respuesta a un estímulo interno (intrínseco) o externo (extrínseco) de muerte celular. Los estímulos pueden variar desde daño del ADN e infección viral hasta señales de desarrollo como las que conducen a la degradación de la cola de un renacuajo .

En las células de mamíferos, una vez que se libera el citocromo c , se une a la proteína citosólica Apaf-1 para facilitar la formación de un apoptosoma. Un estudio bioquímico temprano sugiere una proporción de dos a uno de citocromo c a apaf-1 para la formación de un apoptosoma. Sin embargo, estudios estructurales recientes sugieren que la proporción de citocromo c a apaf-1 es de uno a uno. También se ha demostrado que el nucleótido dATP como tercer componente se une a apaf-1, sin embargo, su papel exacto aún se debate. El apoptosoma de mamífero nunca se había cristalizado, pero un apoptosoma humano APAF-1/citocromo-c se ha fotografiado a menor resolución (2 nm ) mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica en 2002, ^[2] revelando una partícula heptamérica similar a una rueda con simetría de 7 pliegues. Recientemente, se ha resuelto también mediante criomicroscopía electrónica una estructura de resolución media (9,5 Ångström) del apoptosoma humano , que permite inferir de forma inequívoca las posiciones de todos los dominios APAF-1 (CARD, NBARC y WD40) y del citocromo c. Ahora también se dispone de una estructura cristalina de la subunidad inactiva monomérica de Apaf-1 (PDB 3SFZ). ^{[1] [3]}

Una vez formado, el apoptosoma puede reclutar y activar la procaspasa-9 inactiva . Una vez activada, esta caspasa iniciadora puede activar las caspasas efectoras y desencadenar una cascada de eventos que conducen a la apoptosis.

El término apoptosoma se introdujo por primera vez en el artículo de Yoshihide Tsujimoto de 1998 "El papel de las proteínas de la familia Bcl-2 en la apoptosis : ¿apoptosomas o mitocondrias ?". ^[4] Sin embargo, antes de esa época el apoptosoma se conocía como un complejo ternario . Este complejo involucraba a la caspasa-9 y a la Bcl-XL , cada una de las cuales se unía a un dominio específico de Apaf-1 . Se creía entonces que la formación de este complejo desempeñaba un papel regulador en la muerte celular de los mamíferos . ^[5] En diciembre del mismo año, se publicó otro artículo en The Journal of Biological Chemistry que afirmaba que Apaf-1 es el regulador de la apoptosis, a través de la activación de la procaspasa-9. ^[6]

Los criterios para la formación de un apoptosoma se establecieron en 1999. En primer lugar, debe ser un complejo grande (más de 1,3 millones de daltons). En segundo lugar, su formación requiere la hidrólisis de un enlace de alta energía de ATP o dATP. Y, por último, debe activar la procaspasa-9 en su forma funcional. La formación de este complejo es el punto de no retorno y se producirá la apoptosis. El complejo multimérico estable APAF-1 y citocromo se ajusta a esta descripción y ahora se denomina apoptosoma. ^[7]

Se pensaba que el apoptosoma era un complejo multimérico por dos razones: en primer lugar, para acercar varias moléculas de procaspasa-9 para su escisión; y en segundo lugar, para elevar el umbral de apoptosis, de modo que la fuga inespecífica de citocromo c no provoque apoptosis. ^[7]

Una vez que el apoptosoma se estableció como el activador de la procaspasa-9, las mutaciones dentro de esta vía se convirtieron en un área de investigación importante. Algunos ejemplos incluyen células de leucemia humana, cáncer de ovario e infecciones virales . ^{[8] [9] [10]} Las áreas de investigación actuales para esta vía se discutirán con más detalle. También existen rutas ocultas para la muerte celular, que son independientes de APAF-1 y, por lo tanto, del apoptosoma. Estas rutas también son independientes de la caspasa-3 y 9. Estas vías ocultas para la apoptosis son más lentas, pero pueden resultar útiles con más investigaciones. ^[11]

El apoptosoma es un complejo holoenzimático multimolecular ensamblado alrededor de la proteína adaptadora Apaf1 (factor activador de la proteasa apoptótica 1) tras la apoptosis mediada por mitocondrias , que debe ser estimulada por algún tipo de señal de estrés. La formación del apoptosoma requiere la presencia de ATP /dATP y citocromo c en el citosol . ^[12] Un estímulo de estrés puede desencadenar la liberación de citocromo c en el citoplasma, que luego se unirá al extremo C de Apaf-1 dentro de una región que contiene múltiples repeticiones WD-40. ^[2] La oligomerización de Apaf-1 parece estar acompañada por el reclutamiento sincronizado de procaspasa-9 al motivo CARD en el extremo N de Apaf-1 . ^[2] El apoptosoma desencadena la activación de caspasas en la vía intrínseca de la apoptosis . ^[12]

El complejo heptamérico en forma de rueda con estructura de simetría séptuple del apoptosoma se reveló por primera vez a una resolución de 27 Å mediante técnicas de criomicroscopía electrónica y tiene una masa calculada de aproximadamente 1 MDa (Acehan et al. 2002). ^[2] Esta partícula con forma de rueda tiene siete radios y un eje central. La región distal del radio tiene una forma de Y pronunciada. ^[12] El dominio del eje está conectado al dominio Y por un brazo doblado. Cada dominio Y comprende dos lóbulos (uno grande y uno pequeño) entre los cuales se encuentran los sitios de unión del citocromo c. ^[12] Debido a que la resolución de la estructura del apoptosoma era relativamente baja, se propusieron dos modelos controvertidos para el ensamblaje del apoptosoma. Un modelo sugiere que los dominios NOD forman el eje central y los dominios CARD forman un anillo más libre en la parte superior de la región NOD. ^[2] Otro modelo propone que Apaf-1 está organizado de manera extendida de tal manera que tanto el CARD N-terminal como la región de unión de nucleótidos forman el eje central del apoptosoma, mientras que las 13 repeticiones WD-40 constituyen los dos lóbulos. ^[12] El lóbulo grande está formado por siete repeticiones y el lóbulo pequeño está formado por seis repeticiones. ^[12] Cada molécula de caspasa-9 se une a un dominio CARD en el eje central, formando una estructura en forma de cúpula. ^[12] Esta controversia ha sido resuelta por una reciente estructura de alta resolución del complejo CARD apoptosoma-procaspasa-9 humano. ^[1] Esta estructura demostró claramente que solo las regiones NOD forman el eje central del apoptosoma (ver imágenes), mientras que CARD está unido de manera flexible a la plataforma del apoptosoma y se desordena en el apoptosoma en estado fundamental. ^[1] Una vez que el apoptosoma se une a la procaspasa-9, los CARD de Apaf-1 y los CARD de procaspasa-9 forman una estructura flexible en forma de disco que se encuentra sobre la plataforma. ^[1] También se ha demostrado que el número de repeticiones de WD-40 es 15 en lugar de 13, ^[1] y está compuesto por una hélice beta de 7 palas y una hélice beta de 8 palas. ^[1]

La evidencia de Wang y colegas indica que la relación estequiométrica de procaspasa-9 a Apaf-1 dentro del complejo es aproximadamente 1:1. ^[7] Esto fue probado además por análisis de espectrometría de masas cuantitativa. ^[13] La estequiometría del citocromo c a Apaf-1 dentro del complejo es 1:1. ^[1] Hay algunos debates sobre si la incorporación estable del citocromo c en el apoptosoma es necesaria después de la oligomerización, pero datos estructurales recientes favorecen la idea de que el citocromo c estabiliza el apoptosoma humano oligomérico. ^[1] Sin embargo, el citocromo c puede no ser necesario para el ensamblaje del apoptosoma en especies no mamíferas, como gusanos y moscas de la fruta. ^[14] Además, se ha informado que varias otras moléculas, especialmente la caspasa-3, copurifican con el apoptosoma ^[7] y se ha demostrado que la caspasa-3 puede unirse al complejo apoptosoma-procaspasa-9. ^[13]

Apaf-1 forma la estructura principal del apoptosoma. Tiene tres regiones distintas: el dominio de reclutamiento de caspasa N-terminal (CARD, residuos 1-90), una región central de unión a nucleótidos y oligomerización (NB-ARC/NOD, 128-586) y una región WD40 C-terminal (613-1248) que componen una proteína de aproximadamente 140 KDa. ^[2]

• El dominio CARD de Apaf-1 interactúa con la procaspasa-9 y está involucrado en el reclutamiento dentro del apoptosoma. ^[2]
• La región NB-ARC/NOD exhibe una similitud de secuencia significativa con la proteína Ced-4 de C. elegans. ^[2]
• La región WD40 C-terminal de Apaf1 contiene 15 repeticiones WD-40 estructuradas en dos dominios con forma de hélice b. ^[1] Las repeticiones WD-40 son secuencias de alrededor de 40 aminoácidos de longitud que terminan en Trp-Asp y suelen estar involucradas en la interacción proteína-proteína. ^[2]

Un enlace corto y dominios a/b de unión de nucleótidos (NBD) que contienen cajas Walker conservadas A (p-loop 155-161) y B (239-243) siguen al dominio CARD N-terminal. ^[2] Las cajas Walker A/B son fundamentales para la unión de dATP/ATP y Mg2+. ^{[1] [2]} Después del NBD hay un dominio helicoidal pequeño (HD1), un segundo enlace y un dominio de hélice alada conservado (WHD). ^[2] La región NOD comprende NBD, HD1 y WHD, creando un dominio ATPasa que es parte de la familia AAA+ de ATPasas . ^{[1] [2]} Hay un dominio superhelicoidal (HD2) presente en la unión entre el NOD y las repeticiones WD-40. ^[1] Las repeticiones WD40 están en grupos de ocho y siete con enlaces que los conectan. ^[1]

Las descripciones anteriores corresponden al apoptosoma humano. Las estructuras complejas del apoptosoma de otros organismos tienen muchas similitudes, pero son de tamaños y números de subunidades bastante diferentes, como se muestra en la figura. El sistema de la mosca de la fruta, llamado Dark, tiene un anillo de 8 subunidades (PDB 4V4L). ^[14] El apoptosoma del nematodo, llamado CED-4, es octamérico pero mucho más pequeño (PDB 3LQQ), y no incluye las regiones que se unirían al citocromo C. ^[15]

El inicio de la acción del apoptosoma corresponde a los primeros pasos en la vía de muerte celular programada (PCD) . En animales, la apoptosis puede ser catalizada de una de dos maneras; la vía extrínseca implica la unión de ligandos extracelulares a receptores transmembrana, mientras que la vía intrínseca tiene lugar en las mitocondrias . ^[16] Esta vía intrínseca implica la liberación de citocromo C de las mitocondrias y la posterior unión a la proteína citosólica Apaf-1 . ^{[16] [17]} Por lo tanto, la liberación de citocromo c es necesaria para el inicio de la acción del apoptosoma; esta liberación se regula de varias maneras, la más importante mediante la detección de los niveles de iones de calcio . ^[16]

Se propone que la liberación del citocromo c se produce de una de dos maneras. En primer lugar, el poro de transición de permeabilidad (PTP), cuando la mitocondria recibe una señal que induce la muerte y libera proteínas del espacio intermembrana (12). El PTP está compuesto por el canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC), la proteína de membrana interna translocador de nucleótidos de adenina (AdNT) y la proteína de matriz ciclofilina D (CyD) (12). Este poro hace que las mitocondrias se hinchen y la membrana mitocondrial externa se rompa (Diamond y McCabe, 2007). Con este cambio en la permeabilidad , proteínas como el citocromo c se liberan al citosol (12). Este cambio probablemente causa la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), donde el potencial transmembrana mitocondrial colapsa y la producción de ATP cesa (12). La inhibición de este método por el agente farmacéutico ciclosporina A (CsA) condujo al descubrimiento de la segunda vía (13). El segundo método de liberación del citocromo c es independiente del PTP e involucra solo al VDAC. Los miembros de la familia Bcl-2 de proteínas proapoptóticas pueden inducir la apertura del VDAC (12). Esto provocará la misma liberación de proteínas del espacio intermembrana, incluido el citocromo c, y la posterior MPT (12).

En ausencia de citocromo c, Apaf-1 existe en su forma monomérica ; se cree que el dominio WD-40 permanece plegado sobre la proteína, manteniendo a Apaf-1 en un estado autoinhibido . ^[16] Además, varias áreas están tan fuertemente unidas que la proteína es incapaz de unirse a nada más. ^[16] Se ha determinado a través de espectrometría de masas que en el estado autoinhibido o "bloqueado", el ADP está unido al dominio ATPasa de Apaf-1. ^[16] En este estado, esta proteína es singular e incapaz de activar ninguna caspasa .

El citocromo c se une al dominio WD-40 de Apaf-1. ^[16] Esto permite que se libere el "bloqueo", lo que significa que este dominio ya no está autoinhibido. ^{[1] [16]} Sin embargo, los dominios CARD y NB-ARC permanecen en estado autoinhibido. ^[16] El dominio CARD solo se liberará de este bloqueo cuando Apaf-1 esté unido a (d) ATP/ATP; cuando el ATP se une, el dominio CARD podrá unirse a la caspasa-9. ^{[1] [16]} Cuando el ADP está en el dominio ATPasa, se inhibe la oligomerización. Por lo tanto, la unión del ATP también permite la oligomerización de Apaf-1 en la estructura heptagonal necesaria para la activación de la caspasa corriente abajo. ^{[1] [7] [16]} Las mutaciones en el dominio ATPasa hacen que la proteína sea inactiva; sin embargo, el método para controlar este intercambio ADP-ATP no está claro. ^{[1] [7] [16]} Por lo tanto, la oligomerización solo puede ocurrir en presencia de 7 moléculas de citocromo c, 7 proteínas Apaf-1 y suficiente (d) ATP/ATP . ^[7] El dominio ATPasa pertenece a la familia AAA+ de ATPasas ; esta familia es conocida por su capacidad de unirse a otros dominios ATPasa y formar hexa- o heptámeros. ^[16] El apoptosoma se considera entonces activo cuando hay siete moléculas de Apaf-1 dispuestas en una estructura de rueda, orientadas de tal manera que los dominios NB-ARC descansan en el centro. ^{[1] [16]}

Este apoptosoma funcional puede entonces proporcionar una plataforma de activación de la caspasa 9. ^{[1] [16]} La caspasa 9 existe como un zimógeno en el citosol y se cree que se encuentra a 20 nM en las células. ^[16] Aunque se sabe que el zimógeno no necesita ser escindido para activarse, ^[16] la actividad de la procaspasa-9 puede aumentar significativamente una vez escindida. ^[13] La primera hipótesis es que el apoptosoma proporciona una ubicación para la dimerización de dos moléculas de caspasa 9 antes de la escisión; esta hipótesis fue favorecida por Reidl y Salvasen en 2007. La segunda es que la escisión tiene lugar mientras la caspasa 9 todavía está en su forma monomérica. ^{[13] [16]} En cada caso, la activación de la caspasa 9 conduce a la activación de una cascada de caspasas completa y la posterior muerte celular. Se ha sugerido que la razón evolutiva para que el complejo proteico multimérico active la cascada de caspasas es garantizar que pequeñas cantidades de citocromo c no provoquen apoptosis accidentalmente. ^[7]

Si bien la apoptosis es necesaria para el funcionamiento natural del cuerpo, las mutaciones de la vía del apoptosoma causan efectos y cambios catastróficos en el cuerpo. Las mutaciones de la vía celular pueden promover la muerte celular o impedirla, creando una gran cantidad de enfermedades en el cuerpo. Las vías de apoptosis mutadas que causan enfermedades son abundantes y tienen un amplio rango desde el cáncer, debido a la falta de actividad del apoptosoma, la enfermedad de Alzheimer debido a demasiada actividad del apoptosoma y muchas otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington . ^[18] Las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington son todas enfermedades relacionadas con la edad e implican un aumento de la apoptosis donde mueren las células que aún pueden funcionar o que contribuyen a la función de soporte del tejido. Apaf-1-ALT es un mutante de Apaf-1 que se encuentra en el cáncer de próstata, que no tiene los residuos 339-1248. Estudios estructurales recientes del apoptosoma demuestran que Apaf-1-ALT no puede formar apoptosoma porque carece de componentes estructurales clave para el ensamblaje. ^[1]

Las anomalías genéticas y bioquímicas dentro de una célula normalmente desencadenan la muerte celular programada para librar al cuerpo de la función y el desarrollo irregulares de las células; sin embargo, las células cancerosas han adquirido mutaciones que les permiten reprimir la apoptosis y sobrevivir. Se han desarrollado quimioterapias como la radiación ionizante para activar estas vías de PCD reprimidas mediante hiperestimulación para promover una PCD normal. ^[19]

El p53 funciona como un supresor tumoral que participa en la prevención del cáncer y se produce de forma natural en las vías apoptóticas. El p53 hace que las células entren en apoptosis e interrumpan la división celular posterior, evitando así que la célula se vuelva cancerosa (16). En la mayoría de los cánceres, es la vía p53 la que ha mutado, lo que da como resultado la falta de capacidad para eliminar las células disfuncionales. La función del p53 también puede ser responsable de una esperanza de vida limitada, donde las mutaciones del gen p53 provocan la expresión de formas dominantes negativas que producen animales de larga vida. Por ejemplo, en un experimento con C. elegans , se descubrió que el aumento de la esperanza de vida de los mutantes p53 dependía del aumento de la autofagia. ^[19] En otro experimento con Drosophila, la mutación p53 tuvo efectos tanto positivos como negativos en la esperanza de vida adulta, lo que concluyó que existía un vínculo entre la diferenciación sexual, la PCD y el envejecimiento. ^[19] Determinar cómo afecta el p53 a la esperanza de vida será un área importante para futuras investigaciones.

La inhibición de la apoptosis es una de las características clave del cáncer, por lo que encontrar formas de manipular y superar esta inhibición para formar el apoptosoma y activar las caspasas es importante en el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer. ^[20] La capacidad de provocar directamente la activación del apoptosoma es valiosa en las terapias contra el cáncer porque los genes cancerosos infectados no pueden destruirse, lo que provoca la continuación de la formación del cáncer. Al activar el apoptosoma mediante un estímulo externo, puede producirse la apoptosis y deshacerse de las células mutadas. Actualmente se están buscando numerosos enfoques para lograr esto, incluidas biomoléculas recombinantes, estrategias antisentido, terapia génica y química combinatoria orgánica clásica para dirigirse a reguladores apoptóticos específicos en el enfoque para corregir la muerte celular excesiva o deficiente en enfermedades humanas. ^[18]

En general, la regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas conduce a la prevención de la apoptosis, que puede solucionarse con inhibidores, y la regulación negativa de las proteínas antiapoptóticas conduce a la inducción de la apoptosis, que se revierte con activadores que pueden unirse y modificar su actividad. Una molécula diana importante en las terapias basadas en la apoptosis es Bcl-2 para el diseño de fármacos. ^[18] Bcl-2 fue el primer oncogén que se descubrió que causaba apoptosis que inhibe el cáncer. Se expresa en exceso en los tumores y es resistente a la quimioterapia. ^[18] Los científicos han descubierto que la unión de depresores a las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 las inhibe y deja a los activadores directos libres para interactuar con Bax y Bak . ^[18]

Otra molécula específica para la terapia del cáncer involucra a la familia de las caspasas y sus reguladores. La inhibición de la actividad de las caspasas bloquea la muerte celular en enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos, accidentes cerebrovasculares, ataques cardíacos y lesiones hepáticas. Por lo tanto, los inhibidores de caspasa son una herramienta farmacológica prometedora que proporciona tratamientos para accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades humanas. Hay varios inhibidores de caspasa que se encuentran actualmente en la etapa preclínica que han mostrado evidencia prometedora de revertir los efectos de algunas enfermedades neurodegenerativas. En un estudio reciente, los investigadores desarrollaron un inhibidor reversible de la caspasa-3 llamado M-826 y lo probaron en un modelo de ratón donde bloqueó el daño del tejido cerebral. Además, se probó en un ratón con enfermedad de Huntington y el inhibidor impidió la muerte de neuronas estriadas, revelando efectos prometedores para un estudio más profundo de este inhibidor de caspasa. ^[18]

La formación del apoptosoma Apaf1/caspasa-9 es un evento crucial en la cascada apoptótica. La identificación de nuevos fármacos potenciales que eviten o estabilicen la formación del complejo apoptosoma activo es la estrategia ideal para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una apoptosis excesiva o insuficiente. ^[18] Recientemente se ha descubierto que la taurina previene la apoptosis inducida por isquemia en cardiomiocitos a través de su capacidad para inhibir la formación del apoptosoma Apaf1/caspasa-9 sin prevenir la disfunción mitocondrial. El posible mecanismo por el cual la taurina inhibe la formación del apoptosoma fue identificado como capaz de reducir la expresión de la caspasa-9, un componente fundamental del apoptosoma. Sin embargo, hay estudios que muestran que Apaf1 y la caspasa-9 tienen funciones independientes además del apoptosoma, por lo que alterar sus niveles también podría alterar la función celular. Por lo tanto, a pesar de los datos experimentales alentadores, varios problemas siguen sin resolverse y limitan el uso de fármacos experimentales en la práctica clínica. ^[18]

El descubrimiento de inhibidores de apoptosomas proporcionará una nueva herramienta terapéutica para el tratamiento de enfermedades mediadas por apoptosis. De particular importancia son aquellos nuevos compuestos capaces de inhibir la estabilidad y la actividad de los apoptosomas, actuando sobre las interacciones proteína-proteína intracelulares sin alterar los niveles transcripcionales de los componentes del apoptosoma. ^[18] Estudios estructurales recientes del apoptosoma pueden proporcionar herramientas valiosas para diseñar terapias basadas en apoptosomas. ^{[1] [13]}

• El mapa de la proteólisis