ANNOVAR

Este enfoque identifica si las variantes de entrada causan cambios en la codificación de proteínas y los aminoácidos afectados por las mutaciones. ^{[ 9 ]} El archivo de entrada puede estar compuesto por exones, intrones, regiones intergénicas, sitios aceptores/donadores de empalme y regiones no traducidas 5′/3′. El objetivo es explorar la relación entre las mutaciones no sinónimas (SNP, indels o CNV) y su impacto funcional en genes conocidos. ^{[ 10 ]} En particular, la anotación basada en genes resaltará el cambio exacto de aminoácidos si la mutación se encuentra en la región exónica y el efecto predicho en la función del gen conocido. Este enfoque es útil para identificar variantes en genes conocidos a partir de datos de secuenciación del exoma completo.

Este enfoque identifica variantes deletéreas en regiones genómicas específicas basándose en los elementos genómicos que rodean al gen. ^{[ 11 ]} Algunas categorías que la anotación basada en regiones tendrá en cuenta son:

1. ¿Se encuentra la variante en una región genómica conservada conocida?: Las mutaciones ocurren durante la mitosis y la meiosis . Si no existe presión selectiva para secuencias de nucleótidos específicas, todas las áreas del genoma mutarían a la misma velocidad. Las regiones genómicas altamente conservadas indican secuencias genómicas esenciales para la supervivencia y/o el éxito reproductivo del organismo . Por lo tanto, si la variante afecta una región altamente conservada, es probable que sea altamente perjudicial. ^{[ 12 ]}
2. ¿La variante se encuentra en un sitio de unión de factor de transcripción predicho ?: El ADN se transcribe en ARN mensajero (ARNm) mediante la ARN polimerasa II . Este proceso puede ser modulado por factores de transcripción que pueden potenciar o inhibir la unión de la ARN polimerasa II. Si la variante interrumpe un sitio de unión de factor de transcripción, la transcripción del gen podría alterarse, provocando cambios en el nivel de expresión génica y/o en la cantidad de proteína producida. Estos cambios podrían causar variaciones fenotípicas.
3. ¿La variante se encuentra en un sitio diana de miRNA predicho ?: El microARN (miRNA) es un tipo de ARN que se une de forma complementaria a una secuencia de ARNm específica para suprimir o silenciar su traducción. Si la variante interrumpe la ubicación diana del miRNA, este podría tener una afinidad de unión alterada al transcrito génico correspondiente, modificando así el nivel de expresión del ARNm. Esto podría afectar aún más los niveles de producción de proteínas, lo que podría causar variaciones fenotípicas.
4. ¿Se prevé que la variante interrumpa una estructura secundaria estable del ARN?: El ARN puede funcionar a nivel de ARN como ARN no codificante o traducirse en proteínas para procesos posteriores. Las estructuras secundarias del ARN son extremadamente importantes para determinar la vida media y la función correctas de dicho ARN. Dos especies de ARN con estructuras secundarias estrictamente reguladas son el ARN ribosómico (ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt), esenciales para la traducción del ARNm a proteína. Si la variante altera la estabilidad de la estructura secundaria del ARN, la vida media del ARN podría acortarse, disminuyendo así su concentración en la célula.

Las regiones no codificantes abarcan el 99 % del genoma humano ^{[ 13 ]} y la anotación basada en regiones es extremadamente útil para identificar variantes en dichas regiones. Este enfoque puede utilizarse con datos de secuenciación del genoma completo (WGS).

Este enfoque identifica variantes documentadas en bases de datos específicas. ^{[ 14 ]} Las variantes se pueden obtener de dbSNP, el Proyecto 1000 Genomas o listas proporcionadas por el usuario. Se puede obtener información adicional a partir de la frecuencia de las variantes en las bases de datos mencionadas o de las puntuaciones de riesgo predichas por PolyPhen, CADD, ClinVar u otras. ^{[ 1 ]} Cuanto menos frecuente sea una variante en la base de datos pública, mayor será su riesgo de ser perjudicial. El investigador puede combinar los resultados de diferentes herramientas de predicción de riesgo para realizar una evaluación más precisa de la variante.

En conjunto, estos enfoques se complementan para filtrar más de 4 millones de variantes en un genoma humano. Se eliminan las variantes comunes con baja puntuación de riesgo para revelar las variantes raras con alta puntuación de riesgo, que podrían ser la causa de enfermedades congénitas.

El software ANNOVAR acepta archivos de entrada basados ​​en texto, incluido el formato VCF (Variant Call Format) , el estándar de oro para la descripción de loci genéticos.

El script de anotación principal del programa annotate_variation.plrequiere un formato de archivo de entrada personalizado, el formato de entrada ANNOVAR (.avinput). Los tipos de archivo comunes se pueden convertir al formato de entrada ANNOVAR para la anotación mediante un script proporcionado (ver más abajo). Es un archivo de texto simple donde cada línea corresponde a una variante y dentro de cada línea hay columnas delimitadas por tabulaciones que representan los campos de coordenadas genómicas básicas (cromosoma, posición inicial, posición final, nucleótidos de referencia y nucleótidos observados), seguidas de columnas opcionales ^{[ 2 ].}

El archivo de entrada ANNOVAR contiene los siguientes campos básicos:

• Cristo
• Comenzar
• Fin
• Árbitro
• Alt

Para un uso básico "directo a la caja":

Una función popular de la herramienta ANNOVAR es el uso de un table_annovar.plscript que simplifica el flujo de trabajo a una sola llamada de línea de comandos, dado que las fuentes de datos para la anotación ya se han descargado. La conversión del archivo VCF se realiza dentro de la llamada a la función, seguida de la anotación y la salida a un archivo compatible con Excel. El script toma varios parámetros para la anotación y genera un archivo VCF con las anotaciones como pares clave-valor dentro de la INFOcolumna del archivo VCF para cada variante genética, por ejemplo, "genomic_function=exonic".

Archivo de salida

Los posibles archivos de salida son un archivo .avinput anotado, CSV , TSV o VCF . Según la estrategia de anotación utilizada (véase la figura a continuación), los archivos de entrada y salida serán diferentes. Es posible configurar los tipos de archivo de salida a partir de un archivo de entrada específico, proporcionando al programa el parámetro correspondiente.

Por ejemplo, si el archivo de entrada del table_annovar.plprograma es VCF, la salida también será un archivo VCF. Si el archivo de entrada es del tipo de formato ANNOVAR, la salida será un archivo TSV por defecto, con la opción de generar un archivo CSV si -csvoutse especifica el parámetro. Al elegir CSV o TSV como tipo de archivo de salida, el usuario puede abrir los archivos para ver las anotaciones en Excel u otra aplicación de hoja de cálculo. Esta es una función muy popular entre los usuarios.

El archivo de salida contendrá todos los datos del archivo de entrada original con columnas adicionales para las anotaciones deseadas. Por ejemplo, al anotar variantes con características como (1) la función genómica y (2) el rol funcional de la variante codificante, el archivo de salida contendrá todas las columnas del archivo de entrada, seguidas de las columnas adicionales "genomic_function" (por ejemplo, con los valores "exonic" o "intronic") y "coding_variant_function" (por ejemplo, con los valores "synonymous SNV" o "non-synonymous SNV").

En pruebas realizadas en un ordenador de sobremesa moderno (  CPU Intel Xeon de 3 GHz, 8 GB de memoria), ANNOVAR requiere aproximadamente 4 minutos para realizar la anotación funcional basada en genes, o unos 15 minutos para la reducción gradual de variantes, para un total de 4,7 millones de variantes. Se considera práctico para realizar la anotación y priorización de variantes en cientos de genomas humanos al día. ^{[ 2 ]}

ANNOVAR puede acelerarse utilizando un -threadargumento que habilita el procesamiento multihilo, de modo que los archivos de entrada puedan procesarse en paralelo.

• Genes UCSC / Ensembl
• hg38
• GENCODE /CCDS

^{[ 9 ]}

• CODIFICAR
• Bases de datos personalizadas que cumplen con el formato GFF3 (Generic Feature Format versión 3).

^{[ 11 ]}

Dado el gran número de fuentes de datos para la anotación basada en filtros, aquí se muestran ejemplos de qué subconjuntos de los conjuntos de datos utilizar para algunos de los casos de uso más comunes. ^{[ 14 ]}

1. Para la frecuencia de variantes en datos de exoma completo : ^{[ 14 ]}
   1. ExAC: con frecuencias alélicas para todos los grupos étnicos.
   2. NHLBI-ESP: a partir de 6500 exomas, utilice tres agrupaciones de población.
   3. Frecuencia alélica de gnomAD: con frecuencias alélicas para múltiples poblaciones
2. Para variantes específicas de la enfermedad: ^{[ 14 ]}
   1. ClinVar: con columnas individuales para cada campo ClinVar para cada variante.
   2. COSMIC: mutaciones somáticas del cáncer y frecuencia de aparición en cada subtipo de cáncer.
   3. ICGC: mutaciones del Consorcio Internacional del Genoma del Cáncer
   4. NCI-60: datos de frecuencia alélica de secuenciación del exoma de un panel de células tumorales humanas

^{[ 14 ]}

ANNOVAR es una de las herramientas de anotación más comunes para identificar mutaciones y genes candidatos y causales de enfermedades genéticas raras.

Utilizando una combinación de anotación basada en genes y en filtros, seguida de una reducción de variantes basada en los valores de anotación de las variantes, se puede identificar el gen causal de una enfermedad mendeliana recesiva rara llamada síndrome de Miller. ^{[ 1 ]}

Esto implicará la síntesis de un conjunto de datos de todo el genoma de aproximadamente 4,2 millones de variantes de un solo nucleótido (SNV ) y aproximadamente 0,5 millones de inserciones y deleciones ( indels ). ^{[ 1 ]} También se incluyen dos mutaciones causales conocidas para el síndrome de Miller (G152R y G202A en el gen DHODH ). ^{[ 1 ]}

Pasos para identificar las variantes causales de la enfermedad utilizando ANNOVAR: ^{[ 1 ]}

1. Anotación basada en genes para identificar variantes exónicas/de empalme de la combinación de SNV e indels (~4,7 millones de variantes) donde se identificaron un total de 24.617 variantes exónicas. ^{[ 1 ]}
2. Dado que el síndrome de Miller es una enfermedad mendeliana rara, solo interesan las variantes que alteran las proteínas exónicas, que suman 11.166. ^{[ 1 ]} De estas, se identificaron 4860 variantes que se encuentran en regiones genómicas altamente conservadas ^{[ 1 ]}
3. Dado que las bases de datos públicas como dbSNP y el Proyecto 1000 Genomas archivan variantes previamente reportadas, que suelen ser comunes, es menos probable que contengan las variantes causales del síndrome de Miller, que son raras. ^{[ 1 ]} Por lo tanto, las variantes encontradas en esas fuentes de datos se filtran y quedan 413 variantes.
4. Luego, se evalúan los genes para determinar si existen múltiples variantes en el mismo gen como heterocigotos compuestos y quedan 23 genes. ^{[ 1 ]}
5. Finalmente, se eliminan los genes "prescindibles", aquellos que presentan mutaciones sin sentido de alta frecuencia (en más del 1% de los sujetos del Proyecto 1000 Genomas ) que son susceptibles a errores de secuenciación y alineación en plataformas de secuenciación de lectura corta. ^{[ 1 ]} Se considera que estos genes tienen menos probabilidades de ser causantes de una enfermedad mendeliana rara . Como resultado, se filtran tres genes y quedan 20 genes candidatos, incluido el gen causal DHODH ^{[ 1 ].}