Venenomica

La venómica es el estudio de las proteínas asociadas con el veneno , una sustancia tóxica secretada por los animales, que generalmente se inyecta de forma ofensiva o defensiva a la presa o a los agresores, respectivamente.

El veneno se produce en una glándula (o glándulas) especializadas y se administra a través de colmillos huecos o un aguijón. La función principal del veneno es alterar los procesos fisiológicos del animal herido a través de mecanismos neurotóxicos o hemotóxicos . Esto puede ayudar en ciertos procesos, como la obtención de presas o la disuasión/escape de depredadores. El veneno ha evolucionado muchas veces en múltiples filos, cada uno de los cuales ha desarrollado sus propios tipos únicos de veneno y métodos de administración de forma independiente. ^[1] Sin embargo, debido a la excesiva cantidad de animales venenosos en el mundo, son la principal causa de muertes relacionadas con animales (~ 57.000 en 2013) que los animales no venenosos (~ 22.000). ^[2] Por ejemplo, las serpientes son responsables de más de 1 a 5 millones de lesiones por mordeduras, 421.000 (a 1,8 millones) envenenamientos y 20.000 (a 94.000) muertes al año. ^[3] Sin embargo, con métodos venenosos, el veneno puede ser utilizado para fabricar sustancias beneficiosas como nuevos medicamentos e insecticidas eficaces. ^{[4] [5]}

El veneno está formado por múltiples componentes proteicos, cada uno de los cuales difiere en su complejidad estructural. El veneno puede ser una mezcla de péptidos simplistas, proteínas de estructura secundaria (hélices α y láminas β) y proteínas de estructura terciaria (estructuras cristalinas). ^[6] Además, dependiendo del organismo, puede haber diferencias fundamentales en las estrategias que incorporan en sus contenidos de veneno, siendo la mayor diferencia entre invertebrados y vertebrados. Por ejemplo, la mayoría del veneno de la araña de tela de embudo estaba formado por péptidos de entre 3 y 5 KDa (75 %), y los péptidos restantes tenían una masa de entre 6,5 y 8,5 KDa. ^[7] Por el contrario, el veneno de serpiente está formado por proteínas más complejas, como proteínas de saliva modificadas (CRISP y calicreína) y familias de proteínas cuyos genes han sido reclutados de otros grupos de tejidos (acetilcolinesterasa, crotasina, defensina y cistatina). ^[8] Debido a esta extraordinaria cantidad de variación en los componentes que forman el veneno, se necesitaba un nuevo campo para identificar y categorizar los millones de moléculas bioactivas que se encuentran dentro del veneno. ^[1] Por lo tanto, al combinar los métodos de múltiples campos como la genómica , la transcriptómica , la proteómica y la bioinformática , surgió un nuevo campo acertadamente llamado venómica.

La venómica se estableció por primera vez en la segunda mitad del siglo XX, cuando diferentes tecnologías "ómicas" comenzaron a ganar popularidad. Sin embargo, la progresión de la venómica desde sus inicios siempre ha dependido y se ha visto limitada por el avance de la tecnología. Juan Calvete llama la atención sobre esto de manera explícita cuando detalla la historia de la venómica. ^[9] Declara que "las últimas revoluciones realizadas en la investigación venómica en la última década (1989-1999) son el resultado directo de los avances realizados en los métodos centrados en la proteómica y el resultado indirecto de formas más ampliamente disponibles y rentables de análisis transcriptómico y bioinformático". Uno de los primeros temas de investigación populares de la venómica fueron las propiedades farmacológicas de las toxinas polipeptídicas que se encuentran en el veneno de serpiente (específicamente, Elapidae e Hydrophidae ) debido a las propiedades neurotóxicas y su capacidad para causar insuficiencia respiratoria en animales. ^[10] Sin embargo, debido a la falta de tecnología competente, técnicas menos complejas (como la diálisis para separar el veneno), seguidas de análisis simplistas de cromatografía y electroforesis , la investigación fue limitada.

La evidencia del interés temprano en el veneno de serpiente fue predominante a lo largo de principios del siglo XX y uno de los primeros grandes avances se produjo a mediados de la década de 1960. Por ejemplo, Halbert Raudonat fue uno de los primeros investigadores en fraccionar el veneno de cobra ( Naja nivea ) utilizando sofisticadas técnicas de diálisis y cromatografía en papel. ^[12] Además, Evert Karlsson y David Eaker pudieron purificar con éxito las neurotoxinas específicas encontradas en el veneno de cobra ( Naja nigricollis ) y descubrieron que esos polipéptidos aislados tenían un peso molecular constante de alrededor de 7000. ^[13]

Las futuras investigaciones en este campo eventualmente conducirían a modelos predictivos indirectos y luego a estructuras cristalinas directas de muchas superfamilias de proteínas importantes. ^{[14] [11]} Por ejemplo, Barbara Low fue una de las primeras en publicar una estructura 3D de la proteína de tres dedos (TFP), Erabutoxin-b. ^[15] Las TFP son un ejemplo de α-neurotoxinas , tienen una estructura pequeña (longitud de ~60-80 aminoácidos) y son un componente predominante que se encuentra en muchos venenos de serpientes (representando hasta el 70%-95% de todas las toxinas). ^{[16] [17]}

En retrospectiva, la venómica ha avanzado mucho en la secuenciación y creación de modelos precisos de moléculas tóxicas mediante los métodos avanzados actuales. A través de estos métodos, también se ha producido una categorización global de los venenos, y se han documentado y puesto a disposición del público los venenos estudiados anteriormente. Un ejemplo de ello sería el "Proyecto de anotación de toxinas animales" (proporcionado por UniProtKB/Swiss-Prot), que es una base de datos que tiene como objetivo proporcionar una fuente de alta calidad y de libre acceso de secuencias de proteínas, estructuras 3D e información funcional sobre miles de venenos/venenos animales. Hasta ahora, han categorizado más de 6.500 toxinas (tanto venenos como venenos) a nivel de proteínas, y la organización general de UniProt ha revisado más de 500.000 proteínas y ha proporcionado los proteomas de 100.000 organismos. Sin embargo, incluso con la tecnología actual, la deconstrucción y catalogación de los componentes individuales de lo que constituye el veneno de un animal requiere una gran cantidad de tiempo y recursos debido a la abrumadora cantidad de moléculas que se encuentran en una sola muestra de veneno. Esto se complica aún más cuando hay algunos animales (por ejemplo, los caracoles cono) que pueden cambiar la complejidad y la composición de su veneno dependiendo de las circunstancias (relacionadas con cuestiones ofensivas o defensivas) del envenenamiento. ^[18] Además, existen diferencias interespecíficas entre machos y hembras de una especie, ya que sus venenos varían en cantidades y toxicidad. ^[19]

El profesor Juan J. Calvete es un prolífico investigador en venómica en el instituto biomédico de Valencia y ha explicado extensamente el proceso involucrado en desenredar y analizar el veneno (una vez en 2007 y recientemente en 2017). ^{[21] [20]}

Estos implican los siguientes pasos:

(1) Recolección de veneno, (2) Separación y cuantificación, (3) Identificación y (4) Representación de los componentes encontrados.

El ordeño de veneno es la forma más simple de recolectar una muestra de veneno. Por lo general, implica que un animal vertebrado (normalmente una serpiente) deposite una mordedura venenosa en un recipiente. De manera similar, se puede utilizar la estimulación eléctrica para animales invertebrados (insectos y arácnidos). ^[22] Esta práctica ha permitido el descubrimiento de las propiedades básicas del veneno y la comprensión de los factores biológicos involucrados en la producción de veneno, como los períodos de regeneración del veneno. Otros métodos implican la disección post mortem de las glándulas venenosas para recolectar los materiales necesarios (veneno o tejido).

Los métodos de separación son el primer paso para descomplejizar la muestra de veneno, siendo un método común la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa ( RP-HPLC ). Este método se puede aplicar ampliamente a casi todos los venenos como un método de fraccionamiento crudo y para detectar los enlaces peptídicos encontrados. También se pueden utilizar técnicas menos comunes como la electroforesis en gel 1D/2D en casos de venenos que contienen péptidos pesados ​​y complejos (preferiblemente >10KDa). Esto significa que, además de la RP-HPLC, la electroforesis en gel puede ayudar a identificar moléculas grandes (como enzimas) y ayudar a refinar el veneno antes de otros métodos analíticos. ^[1] A continuación, se utiliza la secuenciación N-terminal para encontrar el orden de aminoácidos de las proteínas/péptidos fraccionados comenzando por el extremo N-terminal. ^[23] Además, se puede realizar SDS‐PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio) en las proteínas aisladas de la RP-HPLC para identificar las proteínas de interés antes de pasar a la etapa de identificación. ^[21]

Hay dos métodos proteómicos predominantemente utilizados para identificar la estructura de un péptido/proteína, la proteómica de arriba hacia abajo ( TDP ) y la proteómica de abajo hacia arriba ( BUP ). La TDP implica tomar muestras fraccionadas de veneno y analizar esos péptidos/proteínas con cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem ( LC-MS/MS ). Esto da como resultado la identificación y caracterización de todos los péptidos/proteínas presentes en la muestra inicial. Mientras que la BUP consiste en fraccionar y descomponer los péptidos/proteínas antes del análisis (LC-MS/MS) mediante reducción química, alquilación y digestión enzimática (normalmente con tripsina). La BUP se utiliza más comúnmente que la TDP, ya que la descomposición de las muestras permite que los componentes cumplan con el rango de masa ideal para el análisis LC-MS/MS. ^{[24] [1]} Sin embargo, ambos métodos de identificación tienen desventajas y limitaciones. Los resultados de BUP son propensos a problemas de inferencia de proteínas, ya que las toxinas grandes se pueden descomponer en toxinas más pequeñas que se muestran en el resultado, pero que no existen de forma natural en la muestra de veneno. Si bien el TDP es el método más nuevo y puede llenar los espacios vacíos que deja el BUP, el TDP necesita instrumentos con un alto poder de resolución (normalmente 50 000 o más). La mayoría de los estudios utilizarán ambos métodos en paralelo para obtener los resultados más precisos. Además, se pueden utilizar métodos transcriptómicos/genómicos para crear bibliotecas de ADNc a partir de las moléculas de ARNm extraídas expresadas en las glándulas venenosas de un animal venenoso. Estos métodos optimizan el proceso de identificación de proteínas al producir las secuencias de ADN de todas las proteínas expresadas en las glándulas venenosas. Un gran problema en el uso del análisis transcriptómico/genómico en estudios venenosos es la falta de secuencias completas del genoma de muchos animales venenosos. Sin embargo, este es un problema pasajero debido a la cantidad de proyectos de genoma completo involucrados en la secuenciación de animales venenosos, como el "proyecto del genoma del sistema venenoso" (lanzado en 2003). ^[25] A través de estos proyectos, varios campos de estudio, como los estudios ecológicos/evolutivos y los estudios venenosos, pueden proporcionar información de apoyo y análisis sistemático de toxinas.

Renata Rodrigues produjo un estudio informativo que detalla tanto el proteoma como el transcriptoma de la cabeza de lanza de Neuwied ( Bothropoides pauloensis ), con todos los métodos descritos anteriormente. ^[26] El proteoma mostró la presencia de nueve familias de proteínas con la mayoría de los componentes pertenecientes a metaloproteinasas de veneno de serpiente (38%), fosfolipasa A2 (31%) y péptidos potenciadores de bradiquinina/ péptidos natriuréticos de tipo C (12%). El transcriptoma proporcionó un ADNc de más de 1100 etiquetas de secuencia expresadas ( EST ), con solo 688 secuencias relacionadas con la glándula venenosa. De manera similar, el transcriptoma mostró resultados coincidentes con el 36% de SVMP siendo la mayoría de los EST seguidos de PLA2 (26%) y secuencias BPP/C-NP (17%). Además, este estudio muestra que a través del uso de la proteómica y la transcriptómica, podemos comprender completamente los componentes dentro del veneno. Esto puede conducir a la estructura molecular y las funciones de muchos componentes bioactivos, lo que puede conducir a la bioprospección de componentes del veneno para fabricar nuevos medicamentos y ayudar a desarrollar mejores métodos para crear antivenenos.

El campo de la venómica ha sido ampliamente renovado desde su origen en el siglo XX y continúa siendo mejorado con métodos contemporáneos como la secuenciación de próxima generación y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear. A partir de esta tendencia, parecería que la venómica mejorará progresivamente en sus capacidades a través de los avances tecnológicos persistentes del siglo XXI. Como se mencionó anteriormente, una ruta potencial que se puede expandir aún más mediante la venómica podría ser la incorporación de moléculas específicas del veneno en medicamentos especializados. El primer ejemplo de esto fue a principios de la década de 1970, cuando se descubrió que el captopril era un inhibidor de las enzimas convertidoras de angiotensina ( ECA ) y tenía los medios para tratar la hipertensión en las personas. ^[27] Glenn King analiza el estado actual de los medicamentos derivados del veneno, con seis medicamentos derivados del veneno aprobados por la FDA y diez más que actualmente se encuentran en ensayos clínicos. ^[28] Michael Pennington ofrece una actualización detallada sobre el panorama actual de los fármacos derivados del veneno y el futuro potencial del campo (Tabla 1). ^[4]

Los antivenenos son otra rama de la medicina que necesita mejorarse debido a los problemas que muchos países en desarrollo enfrentan con los animales venenosos. Lugares como el sur/sudeste de Asia y el África subsahariana son donde ocurren muchos casos de morbilidad (amputación de extremidades) y mortalidad. ^[29] Las serpientes (especialmente Elapidae y Viperidae ) son la principal causa de envenenamientos y los antivenenos escasean constantemente en áreas de alto riesgo debido a los extenuantes métodos de producción (animales inmunizados) y las estrictas preferencias de almacenamiento (almacenamiento constante por debajo de 0 ^° C). Este problema continúa, cuando el medicamento en sí tiene efectos limitados en el tejido localizado e inevitablemente causa reacciones agudas (anafilácticas o pirogénicas) y tardías (tipo enfermedad del suero) en la mayoría de los pacientes. ^[30] Sin embargo, al usar diferentes tecnologías "ómicas", el uso de "Antivenomics" puede potencialmente hacer que haya formas más seguras, más rentables y que requieran menos tiempo de producir antivenenos para una variedad de organismos tóxicos. Hoy en día, incluso se están investigando nuevos métodos antiveneno con el uso de anticuerpos monoclonales ( mAbs ) y la expansión de bases de datos venenosas, lo que permite enfoques más efectivos al detectar la reactividad cruzada de los antivenenos. ^{[31] [32]} Por último, la agricultura se puede mejorar mediante técnicas venómicas mejoradas a través de la invención de biopesticidas específicos para insectos creados a partir del veneno. Los insectos son una plaga agrícola/hortícola y actúan como vectores/portadores de muchos parásitos y enfermedades. ^[33] Por lo tanto, siempre se necesitan insecticidas efectivos para controlar los efectos destructivos de muchas especies de insectos. Sin embargo, muchos insecticidas utilizados en el pasado no cumplen con las regulaciones actuales y han sido prohibidos debido a efectos nocivos, como afectar a especies no objetivo ( DDT ) y tener un alto nivel de toxicidad para los mamíferos ( Neonicotinoides ). ^[34] Monique Windley propone que el veneno de los arácnidos es una posible solución a este problema debido a la abundancia de compuestos neurotóxicos presentes en su veneno (se pronostican 10 millones de péptidos bioactivos) y debido a que su veneno es específico para los insectos. ^[5]

Tabla 1. Medicamentos derivados del veneno analizados por Pennington, Czerwinski et al., (2017). ^[4]