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Translatómicos

El translatoma se caracteriza mediante el análisis de polisomas, el análisis de huellas ribosómicas, TRAP-seq, RNC-seq y otras técnicas translatómicas. La translatómica es el es...

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El translatoma se caracteriza mediante el análisis de polisomas, el análisis de huellas ribosómicas, TRAP-seq, RNC-seq y otras técnicas translatómicas.

La translatómica es el estudio de todos los marcos de lectura abiertos (ORF) que se traducen activamente en una célula u organismo . Este conjunto de ORF se denomina translatoma . Caracterizar el translatoma de una célula puede proporcionar información sobre la variedad de vías biológicas activas en ella. Según el dogma central de la biología molecular , el ADN de una célula se transcribe para producir ARN , que posteriormente se traduce para producir una proteína . Miles de proteínas están codificadas en el genoma de un organismo , y las proteínas presentes en una célula realizan de forma cooperativa numerosas funciones para mantener la vida celular. En diversas condiciones, como durante el estrés o en momentos específicos del desarrollo, la célula puede requerir la activación de diferentes vías biológicas y, por lo tanto, un conjunto distinto de proteínas. Dependiendo de las condiciones intrínsecas y ambientales, el conjunto de proteínas que se sintetizan en un momento dado varía. Las técnicas translatómicas permiten obtener una "instantánea" de este conjunto de ORF que se traducen activamente, lo que proporciona información sobre las vías biológicas que la célula está activando en las condiciones presentes. [ 1 ]

Por lo general, la técnica de perfilado de ribosomas se utiliza para obtener información del translatoma. [ 2 ] Los avances recientes, incluido el perfilado de ribosomas de células individuales, han mejorado significativamente la resolución de estos estudios, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la traducción a nivel de células individuales. [ 3 ] Esto es particularmente importante para poblaciones celulares heterogéneas, donde las mediciones globales pueden enmascarar diferencias importantes entre células en la síntesis de proteínas. Otros métodos son el perfilado de polisomas , el perfilado de ARNm traductor de longitud completa ( RNC-seq ) y la purificación de afinidad de ribosomas traductores (TRAP-seq). [ 4 ] A diferencia del transcriptoma , el translatoma es una aproximación más precisa para estimar el nivel de expresión de algunos genes , ya que la correlación entre el proteoma y el translatoma es mayor que la correlación entre el transcriptoma y el proteoma. [ 5 ]

Historia

Cerca de la finalización del Proyecto Genoma Humano , el campo de la genética estaba cambiando su enfoque hacia la determinación de las funciones de los genes. Esto implicaba catalogar otras colecciones de materiales biológicos, como el ARN y las proteínas en las células. Estas colecciones de materiales se denominaron -omas, lo que evocó el entusiasmo generalizado en torno a la secuenciación del genoma humano. El término translatoma fue propuesto por primera vez en 2001 por Greenbaum et al. [ 6 ] El translatoma tenía como objetivo describir las cantidades relativas de proteínas en un proteoma . Actualmente, el término translatoma generalmente se refiere a la colección de proteínas que se crean activamente en una célula. La translatómica, en combinación con la degradómica , tiene como objetivo describir el cambio neto en el proteoma bajo diferentes condiciones.

Relevancia y contribución a la ómica

El objetivo de la genómica es estudiar el genoma, o el conjunto de material genético de un organismo. Los subcampos de la genómica, u otras ómicas , como la transcriptómica y la proteómica , buscan caracterizar la función del genoma cuantificando sus productos (como el ARN y las proteínas) en diferentes condiciones. De esta manera, las ómicas permiten comprender los distintos niveles de regulación de la expresión génica y, por lo tanto, la función del genoma. Sin embargo, estos campos caracterizan biomoléculas que ya se han formado. En algunos casos, la abundancia de ARN o proteínas no refleja la función, ya que estas biomoléculas pueden degradarse rápidamente o permanecer en la célula mucho después de su síntesis inicial. Al utilizar técnicas de proteómica para estudiar el proteoma , la regulación de la abundancia de proteínas a nivel de modificación postraduccional y degradación proteica puede enmascarar procesos reguladores anteriores. Debido a que las funciones celulares a menudo se regulan a nivel de traducción, lo que significa que el transcriptoma no siempre refleja la función del genoma, [ 1 ] el uso de técnicas translatómicas para estudiar el translatoma puede permitir observar la regulación de la función del genoma que estaría oculta en los estudios de transcriptómica o proteómica.

Métodos

Traducción del ARNm

La mayoría de las técnicas de translatómica se centran en caracterizar los ARNm que están unidos a los ribosomas y, por lo tanto, se están traduciendo.

Perfilado de polisomas

El perfilado de polisomas es una técnica utilizada para caracterizar el grado de traducción de uno o más ARNm. Un ARNm altamente traducido existe como un polisoma , lo que significa que está complejizado con múltiples ribosomas. Los ARNm traducidos a niveles más bajos están complejizados con menos ribosomas. En el perfilado de polisomas, se utiliza un gradiente de sacarosa para separar los complejos moleculares en un lisado celular según su tamaño. [ 7 ] Las fracciones de la columna se analizan mediante secuenciación u otros métodos. La tasa de traducción de los ARNm se determina en función de su detección y abundancia en las fracciones de menor y mayor peso molecular.

RNC-seq

La secuenciación de ARNm de longitud completa (RNC-seq) implica la centrifugación de una muestra lisada sobre una capa de sacarosa. Esto permite la separación del complejo ribosoma-cadena naciente (RNC) del ARNm libre y otros componentes celulares. Los RNC forman un precipitado durante la centrifugación que se recoge para su posterior análisis. El ARNm que se está traduciendo en estos RNC se puede secuenciar, lo que permite la identificación y cuantificación de los ARNm que se están traduciendo en ese momento. [ 1 ] [ 8 ] Sin embargo, los complejos RNC-ARNm son frágiles, lo que puede provocar la disociación de los ribosomas de los ARNm y su degradación, sesgando potencialmente los resultados obtenidos. [ 1 ]

Ribo-seq/perfiles de ribosomas/huella de ribosomas

En el perfilado de ribosomas , el ARNm celular, incluidos los polisomas, se somete a ribonucleasas , enzimas que cortan el ARN. Las posiciones en las moléculas de ARN a las que se unen los ribosomas quedan protegidas contra la digestión. Tras el cese de la actividad de la ribonucleasa, estos sitios protegidos pueden recuperarse y secuenciarse. Por lo tanto, las secuencias obtenidas mediante ribo-seq representan fragmentos de ARNm que se estaban traduciendo activamente. [ 9 ]

Secuencia TRAP

La técnica TRAP-seq se utiliza para identificar ARNm que se traducen activamente en un tipo celular específico dentro de un tejido u otro conjunto de células. El tipo celular de interés se modifica genéticamente para expresar una subunidad ribosómica fusionada a una etiqueta de epítopo, como la proteína verde fluorescente . [ 10 ] Tras la lisis celular, se utilizan anticuerpos dirigidos al epítopo para aislar los ARNm unidos a los ribosomas que contienen las proteínas de fusión. Este ARN se convierte posteriormente en ADNc y se secuencia. Esta técnica identifica específicamente los ARNm que se traducen en el tipo celular de interés.

Polipéptidos nacientes

Estados plegables

Espectrometría de masas

Los métodos de espectrometría de masas no permiten determinar el plegamiento de los polipéptidos nacientes . Actualmente no existen métodos que examinen los estados de plegamiento de los polipéptidos nacientes de forma global en la célula. Existen métodos para examinar el estado de plegamiento de polipéptidos nacientes individuales. [ 1 ]

Un método utiliza una proteasa no específica para escindir el péptido naciente a baja temperatura. La proteasa puede escindir las regiones desplegadas y flexibles, pero no las regiones plegadas de forma compacta. Los productos de la escisión se pueden separar y estudiar para determinar las regiones plegadas del péptido naciente. [ 1 ] [ 11 ]

Resonancia Magnética Nuclear

Para analizar la estructura completa de un polipéptido naciente, se utiliza la resonancia magnética nuclear (RMN) . La RMN permite una visión dinámica de las moléculas en solución y, por lo tanto, puede utilizarse en complejos ribosoma-cadena naciente (RNC) . El marcaje de los ribosomas permite filtrar los datos de RMN para detectar señales de ribosomas sospechosos e identificar la señal del polipéptido naciente. [ 12 ]

Identificación y cuantificación

Si bien la estructura de los polipéptidos nacientes actualmente no se puede examinar a escala global, su identificación y cuantificación sí lo son.

Marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares

Un método utiliza una variante del marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares (SILAC). SILAC marca las proteínas con isótopos estables para permitir la cuantificación, comparando péptidos marcados y no marcados. El SILAC pulsado (pSILAC) solo permite marcar los péptidos creados durante el pulso. En teoría, esto permite capturar únicamente péptidos nacientes para su cuantificación. Sin embargo, SILAC requiere niveles similares de proteínas marcadas y no marcadas para una cuantificación precisa. Por lo tanto, los pulsos de pSILAC deben durar mucho más que el proceso de traducción, lo que hace que la cuantificación de péptidos nacientes sea imprecisa. [ 1 ] [ 13 ]

Etiquetado de aminoácidos no canónicos bioortogonal/cuantitativo

El etiquetado de aminoácidos no canónicos bioortogonal/cuantitativo (BONCAT/QuaNCAT) utiliza azidohomoalanina (AHA) para marcar proteínas. Esto permite aislar proteínas recién creadas para espectrometría de masas (EM). [ 14 ] [ 15 ] Sin embargo, el uso de AHA requiere la predepleción de metionina intracelular y la introducción de AHA, lo que estresa la célula y puede alterar la dinámica de traducción interna. De forma similar a pSILAC, los métodos con AHA requieren pulsos más largos, lo que limita su eficacia en la cuantificación de péptidos nacientes. [ 1 ] [ 13 ]

Proteómica de la cadena naciente asociada a la puromicina

La proteómica de cadena naciente asociada a puromicina (PUNCH-P) utiliza un marcador de puromicina-biotina para capturar polipéptidos nacientes para espectrometría de masas (EM). Si bien no altera el proceso celular, es menos sensible que otros métodos para detectar péptidos nacientes. [ 1 ] [ 13 ] Además de estos métodos de cuantificación, se están desarrollando otros métodos basados ​​en EM.

Degradación del ARNm

La degradación del ARNm también desempeña un papel importante en la regulación del proceso de traducción.

Para explorar los mecanismos de degradación, el mapeo genómico de transcritos sin caperuza y clivados (GMUCT), el análisis paralelo de los extremos del ARN (PARE) y la secuenciación del degradoma utilizan la ligasa T4 de la plataforma de secuenciación Illumina para secuenciar los ARNm sin caperuza. La ligasa T4 se une al ARN con un monofosfato 5' libre. Dado que los ARNm maduros tienen una caperuza 5', no se unen como sustratos, dejando los ARNm sin caperuza y en degradación disponibles para unirse. [ 16 ]

La secuenciación de extremos monofosforilados 5′ (5Pseq) captura secuencias tanto con caperuza como sin ella, lo que permite la secuenciación tanto del ARNm maduro como de los productos degradados. Esto ayuda a identificar los productos de degradación del ARNm y tiene aplicaciones en el estudio del bloqueo ribosomal. [ 1 ] [ 17 ]

Estos métodos estudian la degradación de 5' a 3', la escisión mediada por miRNA y la degradación de ARNm mediada por codones de terminación prematura , pero no pueden medir la degradación de 3' a 5' ni otros mecanismos de degradación.

Seguimiento de traducción in vivo

Las técnicas anteriores requieren la lisis de las células y, por lo tanto, no pueden realizarse en células vivas. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) y el seguimiento de la cadena naciente (NCT) utilizan la fluorescencia para rastrear la actividad traslacional. Ambos métodos rastrean las tasas de elongación de los polipéptidos en ARNm individuales. [ 18 ] [ 19 ] Sin embargo, ninguna de las técnicas es capaz de un alto rendimiento. [ 1 ]

ARNt

El ARN de transferencia (ARNt) es una parte importante de la traducción . Los ARNt leen el ARNm, transportando los aminoácidos que el ribosoma ensambla en un polipéptido. Por lo tanto, la abundancia y los tipos de ARNt tienen un gran efecto en la velocidad de la síntesis de proteínas. [ 20 ] Los ARNt pueden ser muy similares entre sí, y algunas especies de ARNt solo difieren en un único nucleótido. Esto, junto con estructuras secundarias y terciarias similares, dificulta la separación de las diferentes especies de ARNt. [ 1 ]

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel 2D es un método clásico utilizado para separar los ARNt. Inicialmente, los ARNt se desnaturalizan en urea 7M y se separan en la primera dimensión del gel. La urea 4M permite un replegamiento parcial para una separación adicional en la segunda dimensión del gel. Este método ha permitido la separación en 48 conjuntos en E. coli y 30 en B. subtilis, pero tiene una resolución limitada. Un gran número de especies diferentes de ARNt no pueden separarse completamente mediante electroforesis en gel 2D, encontrándose solo 62 puntos para los 269 ARNt de rata. [ 21 ]

Cromatografía líquida

La cromatografía líquida de alto rendimiento puede utilizarse para separar los ARNt en función de los isoaceptores de ARNt aminoacilados. Este método no permite separar completamente las especies de ARNt ni distinguir entre codones, aunque sí puede detectar diferencias cuantitativas entre distintas líneas celulares. [ 21 ]

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (EM) puede utilizarse para separar los ARNt basándose en productos de digestión de endonucleasas únicos. [ 22 ] Sin embargo, esto tiene una resolución limitada con mezclas de 30 especies de ARNt y requiere fraccionamiento previo a la EM en grupos más grandes de ARNt. Tampoco puede utilizarse para identificar especies de ARNt de novo, ya que requiere conocimiento previo de los patrones de digestión de las especies de ARNt. [ 21 ]

Microarrays

Los microarrays basados ​​en hibridación utilizan la secuencia conservada 3'CCA en los ARNt para unir una sonda fluorescente. Posteriormente, se utilizan sondas de 70-80 nucleótidos de longitud, que cubren la longitud del ARNt, para unirse a los ARNt. Los ARNt con al menos 8 diferencias de bases pueden distinguirse con microarrays, pero los ARNt con diferencias menores se unen a la misma sonda. [ 21 ]

Transcripción inversa cuantitativa

La PCR cuantitativa en tiempo real con transcripción inversa (qRT-PCR) es otra forma de identificar y cuantificar el ARNt. Se utiliza un cebador para la secuencia conservada 3'CCA para iniciar la transcripción inversa de todas las especies de ARNt. La modificación intensa de los nucleótidos del ARNt y la estabilidad de la molécula de ARNt pueden ser un problema, por lo que se han utilizado altas temperaturas y desmetilación para contrarrestarlos. La desmetilación también se ha utilizado para contrarrestar los errores que la metilación intensa induce en la secuenciación. [ 1 ]

similar a Ribo-seq

Ribo-tRNA-seq se ha desarrollado para observar más de cerca el papel del ARNt en la traducción. De forma similar a Ribo-seq, Ribo-tRNA-seq captura moléculas de ARNt en los ribosomas para la preparación de la biblioteca antes de la secuenciación. [ 23 ]

Véase también

Referencias

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  2. ↑ King HA, Gerber AP (enero de 2016). "Perfilado del translatoma: métodos para el análisis a escala genómica de la traducción del ARNm" . Briefings in Functional Genomics . 15 (1): 22–31 . doi : 10.1093/bfgp/elu045 . PMID 25380596 . 
  3. ↑ Ozadam H, Tonn T, Han CM, Segura A, Hoskins I, Rao S; et al. (2023). " Cuantificación unicelular de la ocupación ribosómica en el desarrollo temprano del ratón" . Nature . 618 (7967): 1057– 1064. doi : 10.1038/s41586-023-06228-9 . PMC 10307641. PMID 37344592 .   {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  4. ↑ Zhao J, Qin B, Nikolay R, Spahn CM, Zhang G (enero de 2019). "Translatomics: La visión global de la traducción" . International Journal of Molecular Sciences . 20 (1): 212. doi : 10.3390/ijms20010212 . PMC 6337585. PMID 30626072 .  
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