Ensayo enzimático

La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y, por lo tanto, depende de varias condiciones físicas que deben especificarse .

Se calcula utilizando la siguiente fórmula:

${\displaystyle \mathrm {a} =\mathrm {n} _ {\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V} }$

dónde

${\displaystyle \mathrm {a} }$= Actividad enzimática

${\displaystyle \mathrm {n} _{\text{t}}}$= Moles de sustrato convertidos por unidad de tiempo

${\displaystyle \mathrm {r} }$= Velocidad de la reacción

${\displaystyle \mathrm {V} }$= Volumen de reacción

La unidad del SI es el katal , 1 katal = 1 mol s⁻¹ (mol por segundo), pero esta es una unidad excesivamente grande. Un valor más práctico y de uso común es ^{la unidad} enzimática (U) = 1 μmol min⁻¹ (micromol por minuto). 1 U corresponde a 16,67 nanokatales . ^{[ 1 ]} 

La actividad enzimática expresada en katal generalmente se refiere a la del sustrato natural objetivo de la enzima. También puede expresarse en función de ciertos sustratos estandarizados, como la gelatina , medida en unidades de digestión de gelatina (UDG), o las proteínas de la leche, medidas en unidades de coagulación de la leche (UCM). Las unidades UDG y UCM se basan en la velocidad con la que un gramo de enzima digiere la gelatina o las proteínas de la leche, respectivamente. 1 UDG equivale aproximadamente a 1,5 UCM. ^{[ 2 ]}

Una mayor cantidad de sustrato aumentará la velocidad de reacción con las enzimas; sin embargo, una vez superado cierto punto, la velocidad de reacción se estabilizará porque la cantidad de sitios activos disponibles se ha mantenido constante.

^{La actividad} específica de una enzima es otra unidad común. Esta representa la actividad de una enzima por miligramo de proteína total (expresada en μmol min⁻¹ ^mg⁻¹ ) . La actividad específica proporciona una medida de la pureza de la enzima en la mezcla. Es la cantidad de micromoles de producto formado por una enzima en un tiempo determinado (minutos) bajo condiciones específicas por miligramo de proteína total. La actividad específica es igual a la velocidad de reacción multiplicada por el volumen de reacción dividido por la masa de proteína total. La unidad del SI es katal/kg, pero una unidad más práctica es μmol/(mg·min).

La actividad específica es una medida de la procesividad de una enzima (la capacidad de la enzima para ser procesada) a una concentración específica (generalmente saturante) del sustrato , y suele ser constante para una enzima pura.

Se puede realizar un proceso de titulación del sitio activo para eliminar errores derivados de diferencias en lotes de cultivo y/o enzimas mal plegadas y problemas similares. Esta es una medida de la cantidad de enzima activa, calculada, por ejemplo, titulando la cantidad de sitios activos presentes mediante el uso de un inhibidor irreversible. La actividad específica debe expresarse entonces como μmol min⁻¹ ^{mg⁻¹ de} enzima activa. Si se conoce el peso molecular de la enzima, el número de recambio , o μmol de producto por segundo por μmol de enzima activa, se puede calcular a partir de la actividad específica. El número de recambio se puede visualizar como la cantidad de veces que cada molécula de enzima realiza su ciclo catalítico por segundo.

La velocidad de una reacción es la concentración de sustrato que desaparece (o producto que se produce) por unidad de tiempo (mol L ⁻¹ s ⁻¹ ).

El porcentaje de pureza se calcula 100 % × (actividad específica de la muestra de enzima / actividad específica de la enzima pura). La muestra impura presenta una actividad específica menor porque parte de su masa no corresponde a la enzima. Si se conoce la actividad específica de la enzima 100 % pura, la muestra impura tendrá una actividad específica menor, lo que permite calcular la pureza y obtener un resultado preciso.

En los ensayos espectrofotométricos , se sigue el curso de la reacción midiendo el cambio en la cantidad de luz que absorbe la solución de ensayo. Si esta luz se encuentra en la región visible, se puede observar un cambio en el color del ensayo; estos se denominan ensayos colorimétricos . El ensayo MTT , un ensayo redox que utiliza un colorante de tetrazolio como sustrato, es un ejemplo de ensayo colorimétrico.

La luz ultravioleta se utiliza con frecuencia, ya que las coenzimas comunes NADH y NADPH absorben la luz ultravioleta en sus formas reducidas , pero no en sus formas oxidadas . Por lo tanto, una oxidorreductasa que utiliza NADH como sustrato podría analizarse siguiendo la disminución de la absorbancia UV a una longitud de onda de 340  nm a medida que consume la coenzima. ^{[ 4 ]}

Ensayos directos versus ensayos acoplados

Incluso cuando la reacción enzimática no produce un cambio en la absorbancia de la luz, aún es posible utilizar un ensayo espectrofotométrico para la enzima mediante un ensayo acoplado . En este caso, el producto de una reacción se utiliza como sustrato de otra reacción fácilmente detectable. Por ejemplo, la figura 1 muestra el ensayo acoplado para la enzima hexoquinasa , que puede analizarse acoplando su producción de glucosa-6-fosfato a la producción de NADPH, utilizando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa .

La fluorescencia se produce cuando una molécula emite luz de una longitud de onda tras absorber luz de una longitud de onda diferente. Los ensayos fluorométricos utilizan la diferencia de fluorescencia entre el sustrato y el producto para medir la reacción enzimática. Estos ensayos suelen ser mucho más sensibles que los espectrofotométricos, pero pueden verse afectados por interferencias causadas por impurezas y por la inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes al exponerse a la luz.

Un ejemplo de estos ensayos es, nuevamente, el uso de las coenzimas nucleotídicas NADH y NADPH. En este caso, las formas reducidas son fluorescentes y las oxidadas no lo son. Por lo tanto, las reacciones de oxidación pueden seguirse mediante una disminución de la fluorescencia y las de reducción mediante un aumento. ^{[ 5 ]} También se dispone de sustratos sintéticos que liberan un colorante fluorescente en una reacción catalizada por enzimas, como el 4-metilumbeliferil-β-D-galactósido para el ensayo de β-galactosidasa o el 4-metilumbeliferil-butirato para el ensayo de lipasa de Candida rugosa . ^{[ 6 ]}

La calorimetría es la medición del calor liberado o absorbido por las reacciones químicas. Estos ensayos son muy generales, ya que muchas reacciones implican algún cambio de calor y, con el uso de un microcalorímetro, no se requiere mucha enzima ni sustrato. Estos ensayos pueden utilizarse para medir reacciones que son imposibles de analizar de otra manera. ^{[ 7 ]}

La quimioluminiscencia es la emisión de luz producida por una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas generan luz, la cual puede medirse para detectar la formación del producto. Este tipo de análisis puede ser extremadamente sensible, ya que la luz producida puede ser capturada por una película fotográfica durante días o semanas, pero puede resultar difícil de cuantificar, puesto que no toda la luz liberada por la reacción será detectada.

La detección de la peroxidasa de rábano picante mediante quimioluminiscencia enzimática (ECL) es un método común para detectar anticuerpos en la transferencia Western . Otro ejemplo es la enzima luciferasa , presente en las luciérnagas, que produce luz de forma natural a partir de su sustrato, la luciferina.

La dispersión de luz estática mide el producto de la masa molar promedio ponderada y la concentración de macromoléculas en solución. Dada una concentración total fija de una o más especies durante el tiempo de medición, la señal de dispersión es una medida directa de la masa molar promedio ponderada de la solución, que variará a medida que se formen o disocien complejos. Por lo tanto, la medición cuantifica la estequiometría de los complejos, así como su cinética. Los ensayos de dispersión de luz para el estudio de la cinética de proteínas son una técnica muy general que no requiere enzimas.

La termoforesis a microescala (MST) ^{[ 8 ]} mide el tamaño, la carga y la entropía de hidratación de moléculas/sustratos en equilibrio. ^{[ 9 ]} El movimiento termoforético de un sustrato marcado con fluorescencia cambia significativamente al ser modificado por una enzima. Esta actividad enzimática puede medirse con alta resolución temporal en tiempo real. ^{[ 10 ]} El consumo de material del método MST totalmente óptico es muy bajo; solo se necesitan 5 μl de volumen de muestra y 10 nM de concentración de enzima para medir las constantes de velocidad enzimática para la actividad y la inhibición. La MST permite a los analistas medir la modificación de dos sustratos diferentes a la vez ( multiplexación ) si ambos sustratos están marcados con diferentes fluoróforos. Por lo tanto, se pueden realizar experimentos de competencia de sustratos.

Los ensayos radiométricos miden la incorporación de radiactividad a los sustratos o su liberación a partir de ellos. Los isótopos radiactivos más utilizados en estos ensayos son el ^14C , ^{el 32P} , ^{el 35S} y ^{el 125I} . Dado que los isótopos radiactivos permiten el marcaje específico de un solo átomo de un sustrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. Se utilizan con frecuencia en bioquímica y a menudo son la única forma de medir una reacción específica en extractos crudos (las mezclas complejas de enzimas que se producen al lisar las células).

La radiactividad se suele medir en estos procedimientos utilizando un contador de centelleo .

Los ensayos cromatográficos miden la formación de productos separando la mezcla de reacción en sus componentes mediante cromatografía . Esto se suele hacer mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero también se puede utilizar la técnica más sencilla de cromatografía de capa fina . Aunque este método puede requerir mucho material, su sensibilidad se puede aumentar marcando los sustratos/productos con una etiqueta radiactiva o fluorescente. La sensibilidad del ensayo también se ha incrementado cambiando los protocolos a instrumentos cromatográficos mejorados (por ejemplo, cromatografía líquida de ultra alta presión) que operan a una presión de bomba varias veces superior a la de los instrumentos HPLC (véase Cromatografía líquida de alta resolución#Presión de bomba ). ^{[ 11 ]}

La mayoría de las enzimas no toleran concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los enlaces iónicos débiles de las proteínas . Las enzimas típicas son activas en concentraciones de sal de 1 a 500 mM. Como es habitual, existen excepciones, como las algas y bacterias halófilas .

Todas las enzimas funcionan dentro de un rango de temperatura específico del organismo. Los aumentos de temperatura generalmente conducen a aumentos en las velocidades de reacción. Existe un límite para el aumento porque las temperaturas más altas conducen a una disminución drástica en las velocidades de reacción. Esto se debe a la desnaturalización (alteración) de la estructura de la proteína resultante de la ruptura de los enlaces iónicos y de hidrógeno débiles que estabilizan la estructura tridimensional del sitio activo de la enzima. ^{[ 12 ]} La temperatura "óptima" para las enzimas humanas suele estar entre 35 y 40 °C. La temperatura promedio para los humanos es de 37 °C. Las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a temperaturas superiores a 40 °C. Las enzimas de las arqueas termófilas que se encuentran en las aguas termales son estables hasta 100 °C. ^{[ 13 ]} Sin embargo, la idea de una velocidad "óptima" de una reacción enzimática es engañosa, ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades, la velocidad de reacción y la velocidad de desnaturalización. Si se utilizara un ensayo que midiera la actividad durante un segundo, daría una actividad alta a temperaturas elevadas; sin embargo, si se utilizara un ensayo que midiera la formación del producto durante una hora, daría una actividad baja a esas temperaturas.    

La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tienen rangos de actividad específicos. Todas poseen un pH óptimo. El pH puede inhibir la actividad enzimática al desnaturalizar (alterar) la estructura tridimensional de la enzima mediante la ruptura de enlaces iónicos y de hidrógeno . La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH de 6 y 8; sin embargo, la pepsina en el estómago funciona mejor a un pH de 2 y la tripsina a un pH de 8.

Al aumentar la concentración del sustrato , aumenta la velocidad de reacción (actividad enzimática). Sin embargo, la saturación enzimática limita la velocidad de reacción. Una enzima se satura cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayor parte del tiempo. En el punto de saturación, la reacción no se acelera, independientemente de la cantidad de sustrato adicional que se añada. La gráfica de la velocidad de reacción se estabiliza.

Grandes cantidades de macromoléculas en una solución alterarán las velocidades y las constantes de equilibrio de las reacciones enzimáticas, a través de un efecto llamado hacinamiento macromolecular . ^{[ 14 ]}