SmURFP

La proteína fluorescente roja ultra pequeña ( smURFP ) es una clase de proteína fluorescente roja lejana desarrollada a través de evolución dirigida a partir de una ficobiliproteína de cianobacteria ( Trichodesmium erythraeum ) , α - aloficocianina . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} La α-aloficocianina nativa requiere una proteína exógena, conocida como liasa , para unir el cromóforo , ficocianobilina. La ficocianobilina no está presente en las células de mamíferos . smURFP fue evolucionada para unir covalentemente la ficocianobilina sin una liasa y fluorescer , unir covalentemente biliverdina (ubicua en las células de mamíferos) y fluorescer, desplazamiento azul de la fluorescencia para coincidir con el fluoróforo orgánico , Cy5 , y no inhibir el crecimiento de E. coli . El gen smURFP se descubrió tras 12 rondas de mutagénesis aleatoria y el análisis manual de 10.000.000 de colonias bacterianas .

smURFP es un homodímero con un máximo de absorción y emisión de 642  nm y 670  nm, respectivamente. Se creó un dímero en tándem smURFP (TDsmURFP) que tiene propiedades similares a smURFP. smURFP es extremadamente estable con una vida media de degradación de la proteína de 17 horas y 33 horas sin y con cromóforo (biliverdina), respectivamente. Esto es comparable a la vida media de degradación de la proteína verde fluorescente mejorada ( eGFP ) derivada de medusas de 24 horas. ^{[ 4 ]} smURFP es extremadamente fotoestable y supera a mCherry ^{[ 5 ]} y tdTomato ^{[ 5 ]} en células vivas. Las moléculas individuales de smURFP emiten el doble de fotones antes del fotoblanqueo que los colorantes de molécula pequeña AlexaFluor647 y Cyanine5. ^{[ 6 ]} El coeficiente de extinción (180 000 M ⁻¹ cm ⁻¹ ) de smURFP es extremadamente grande y tiene un rendimiento cuántico modesto (0,18), lo que hace que su brillo biofísico sea comparable al de eGFP y ~2 veces más brillante que la mayoría de las proteínas fluorescentes rojas o rojo lejano derivadas del coral . smURFP tiene la sección transversal de dos fotones más grande medida para una proteína fluorescente . Hay dos secciones transversales máximas de 1060 y 60 GM a 820 y 1196 nm , respectivamente. ^{[ 6 ]} A pesar de ser un homodímero, todas las fusiones N- y C-terminales probadas muestran una localización celular correcta, incluida la difícil fusión a α-tubulina y Lamin B1 ( Figura ). ^{[ 1 ]} smURFP recibe su nombre de los Pitufos , debido a su apariencia azul claro en luz blanca. ^{[ 1 ]}

Se determinó la estructura cristalina de la smURFP ( PDB: 7UQA ) y se utilizó para comprender la evolución dirigida . La smURFP también se comparó con la α-aloficocianina parental . ^{[ 6 ]} La estructura cristalina de un mutante de smURFP ( PDB : 6FZN ) fue publicada por Fuenzalida-Werner et al. ^{[ 7 ]} Los mutantes muestran bolsillos cromóforos y volumen de proteína significativamente mayores, lo que resulta en un rendimiento cuántico disminuido. ^{[ 6 ]} Una revisión de 2020 analiza las aplicaciones recientes de la smURFP como sonda genéticamente codificada o exógena para imágenes in vivo y analiza los problemas con la disponibilidad de biliverdina . ^{[ 8 ]}

La proteína smURFP libre tiene  un diámetro de 2-3 nm. Se pueden sintetizar nanopartículas de smURFP de aproximadamente 10-14 nm de diámetro en una emulsión de aceite y agua , las cuales conservan su fluorescencia. Estas nanopartículas de proteína fluorescente son estables en ratones vivos y resultan útiles para la obtención de imágenes de fluorescencia tumoral no invasivas . ^{[ 9 ]} 

La smURFP purificada sobrevive a los ultrasonidos y a la fijación , lo que permite la obtención de imágenes de fluorescencia de la administración de macromoléculas mediante ultrasonidos en las córneas . ^{[ 10 ]}

La proteína smURFP libre, purificada y no codificada genéticamente, puede encapsularse en virus y utilizarse para la obtención de imágenes de fluorescencia no invasivas de la biodistribución en ratones vivos. ^{[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]}

smURFP se une covalentemente a la biliverdina para activar la fluorescencia y es intrínsecamente un sensor de biliverdina. Los investigadores demostraron que smURFP purificado tiene un límite de detección de 0,4 nM para la biliverdina en suero humano . ^{[ 14 ]} smURFP permite la creación de ensayos in vitro para detectar la actividad enzimática . Se desarrolló un ensayo para la trombina con un rango de detección de 1,07 aM a 0,01 mM y un límite de detección de 0,2 aM. ^{[ 15 ]}

El dímero en tándem smURFP (TDsmURFP) se utilizó como marcador fluorescente exógeno para etiquetar el receptor Smoothened (SMO) de siete dominios transmembrana. El TDsmURFP se purificó a partir de E. coli y se unió a SMO mediante conjugación mediada por sortasa para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . ^{[ 16 ]} Este novedoso marcaje con proteína fluorescente exógena evita el cribado de múltiples sitios de inserción de proteínas, disolventes orgánicos y reacciones químicas que provocan el plegamiento incorrecto, la inactivación o la degradación de las proteínas.

La proteína fluorescente roja ultra pequeña (smURFP) es una proteína de autoetiquetado similar a las etiquetas Halo , SNAP y CLIP . La etiqueta smURFP acepta un sustrato de biliverdina modificado en un grupo carboxilato con un enlace de polietilenglicol (PEG) a la molécula de carga. A diferencia de las etiquetas Halo, SNAP y CLIP, que utilizan el sustrato solo para unir covalentemente la molécula de carga, la biliverdina es fluorogénica , y la fluorescencia se activa con la unión covalente a la etiqueta smURFP para permitir el seguimiento de la molécula de carga mediante fluorescencia en el rojo lejano en células vivas. La biliverdina también extingue la fluoresceína de la molécula de carga para permitir la obtención de imágenes sin necesidad de eliminar el sustrato. La modificación de la biliverdina en un único grupo carboxilato crea una molécula neutra que atraviesa la membrana externa y nuclear de las células de mamíferos . ^{[ 18 ]}

A pesar de mostrar un brillo biofísico comparable al de la eGFP cuando se normalizó la proteína purificada, esto no se observó en células vivas. Esto sugiere que no había suficiente cromóforo (biliverdina) dentro de las células. La adición de biliverdina aumentó la fluorescencia, pero la smURFP con biliverdina no fue comparable a la eGFP. La biliverdina tiene dos grupos carboxilo a pH neutro , lo que inhibe su entrada celular. El éster dimetílico de biliverdina es un análogo más hidrofóbico y atraviesa fácilmente la membrana celular . La smURFP con éster dimetílico de biliverdina muestra una fluorescencia comparable a la de la eGFP en las células y es más brillante que las proteínas fluorescentes fitocromo bacterianas .

El cromóforo libre se puede diferenciar del cromóforo unido a smURFP mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia ( FLIM ) en células vivas. El éster dimetílico de biliverdina libre (BVMe2) tiene un tiempo de vida de fluorescencia de 0,586 ns, mientras que el BVMe2 unido a smURFP tiene un tiempo de vida de fluorescencia de 1,27 ns . ^{[ 6 ]}

En ratones, la fluorescencia de smURFP es visible en xenoinjertos de tumores HT1080 sin biliverdina exógena, pero la fluorescencia es menor que la de las proteínas fluorescentes rojas derivadas de coral, mCherry ^{[ 5 ]} y mCardinal. ^{[ 19 ]} La fluorescencia visible no siempre es útil y las proteínas fluorescentes siempre deben compararse con otras proteínas fluorescentes útiles codificadas genéticamente. La inyección intravenosa de biliverdina exógena o éster dimetílico de biliverdina no aumenta la fluorescencia de smURFP expresada en tumores después de 1 a 24 horas. La espectrometría de masas mostró que los grupos éster se eliminaron rápidamente del éster dimetílico de biliverdina. La adición de 25 μM de biliverdina o éster dimetílico de biliverdina aumentó drásticamente la fluorescencia de los tumores extirpados y smURFP está presente sin cromóforo. Se necesita más investigación para optimizar la disponibilidad del cromóforo en ratones para obtener una fluorescencia comparable o mayor que la de las proteínas fluorescentes rojas derivadas de coral .

El éster dimetílico de biliverdina, biliverdina o ficocianobilina se disuelve en DMSO a una concentración de 5 mM. La solución es muy oscura y pipetea vigorosamente para asegurar su completa disolución. El éster dimetílico de biliverdina no es soluble en tampones comunes , incluyendo la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución salina balanceada de Hank (HBSS). Agrega 1-5 μM de éster dimetílico de biliverdina en medios o tampón que contengan 10% de suero fetal bovino (FBS). Agrega 25 μM de biliverdina (no como permeante de membrana) a las células . La biliverdina no satura los sitios smURFP y no alcanza la máxima intensidad de fluorescencia. Se debe usar éster dimetílico de biliverdina para obtener la máxima intensidad de fluorescencia. Incuba smURFP con el cromóforo durante el mayor tiempo posible para aumentar la acumulación de proteína causada por la mayor estabilidad de la proteína con el cromóforo . Deja el cromóforo durante un mínimo de 3 horas y se recomiendan 24 h. Retire el cromóforo , lave con un medio que contenga 10 % de FBS y tome la imagen en un medio sin rojo de fenol ni tampón de imagen .

Sensor FRET de quinasa . smURFP es un aceptor útil para muchas proteínas fluorescentes rojas debido a la superposición espectral. Una proteína fluorescente roja diseñada racionalmente, stagRFP, permite una creación más sencilla de sensores FRET . stagRFP es un donador FRET útil para el aceptor rojo lejano smURFP y se creó un reportero FRET de la quinasa ERK con una respuesta promedio de ~15%. El nuevo sensor permitió la visualización simultánea de tres quinasas, Src , Akt , ERK , en una sola célula . ^{[ 20 ]} Imágenes fluorescentes del ciclo celular . El trabajo pionero de Atsushi Miyawaki y colaboradores desarrolló el indicador fluorescente del ciclo celular basado en ubiquitinación (FUCCI), que permite la obtención de imágenes fluorescentes del ciclo celular. Originalmente, una proteína fluorescente verde , mAG, se fusionó con hGem(1/110) y una proteína fluorescente naranja (mKO ₂ ) se fusionó con hCdt1(30/120). Nótese que estas fusiones son fragmentos que contienen una señal de localización nuclear y sitios de ubiquitinación para su degradación , pero no son proteínas funcionales. La proteína fluorescente verde se produce durante la fase S, G2 _o M y se degrada durante la fase G0 _o G1 _, mientras que la proteína fluorescente naranja se produce durante la fase G0 _o G1 _y se destruye durante la fase S, G2 _o M. ^{[ 21 ]} Se desarrolló un FUCCI de rojo lejano e infrarrojo cercano utilizando una proteína fluorescente derivada de cianobacterias (smURFP) y una proteína fluorescente derivada de bacteriofitocromo ( vídeo disponible en este enlace ). ^{[ 1 ]}

• SmURFP KX449134 y TDsmURFP, KX449135 - Códigos de acceso de GenBank/EMBL/DDBJ
• Entrada de FPbase
• Obtén ADN plasmídico en Addgene (organización sin ánimo de lucro para compartir ADN).
• Estructura cristalina de 7UQA smURFP.