Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Represilador

El represilador es una red reguladora genética que consta de al menos un bucle de retroalimentación con al menos tres genes, cada uno de los cuales expresa una proteína que repr...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

El represilador es una red reguladora genética que consta de al menos un bucle de retroalimentación con al menos tres genes, cada uno de los cuales expresa una proteína que reprime al siguiente gen en el bucle. [ 1 ] En la investigación biológica, los represiladores se han utilizado para construir modelos celulares y comprender la función celular. Existen represiladores tanto artificiales como naturales. Recientemente, se ha estudiado el circuito genético del reloj del represilador natural en Arabidopsis thaliana ( A. thaliana ) y en sistemas de mamíferos.

Represiladores artificiales

Los represores artificiales fueron diseñados por primera vez por Michael Elowitz y Stanislas Leibler en 2000, [ 2 ] complementando otros proyectos de investigación que estudiaban sistemas simples de componentes y funciones celulares. Para comprender y modelar el diseño y los mecanismos celulares que confieren la función a una célula, Elowitz y Leibler crearon una red artificial que consistía en un bucle con tres represores transcripcionales . Esta red fue diseñada desde cero para exhibir una oscilación estable que actúa como un sistema oscilador eléctrico con periodos de tiempo fijos. La red se implementó en Escherichia coli ( E. coli) mediante transferencia de ADN recombinante. Luego se verificó que las colonias modificadas exhibían efectivamente el comportamiento oscilatorio deseado.

El represilador consta de tres genes conectados en un bucle de retroalimentación , de modo que cada gen reprime al siguiente en el bucle y es reprimido por el anterior. En la inserción sintética en E. coli , se utilizó la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador para poder observar el comportamiento de la red mediante microscopía de fluorescencia .

La red reguladora genética represiladora, en la que cada proteína traducida por un gen reprime a la siguiente en el ciclo.

El diseño del represilador se guió por principios biológicos y de circuitos, con modelos de análisis discretos y estocásticos . Se emplearon seis ecuaciones diferenciales para modelar la cinética del sistema represilador, basándose en las concentraciones de proteína y ARNm , así como en los valores apropiados de los parámetros y del coeficiente de Hill . En el estudio, Elowitz y Leibler generaron figuras que muestran las oscilaciones de las proteínas represoras, utilizando integración y valores típicos de parámetros, así como una versión estocástica del modelo del represilador con parámetros similares. Estos modelos se analizaron para determinar los valores de diversas tasas que producirían una oscilación sostenida. Se encontró que estas oscilaciones se veían favorecidas por promotores acoplados a sitios de unión ribosómica eficientes , represores transcripcionales cooperativos y tasas de degradación de proteína y ARNm comparables.

Este análisis motivó dos características de diseño que se incorporaron a los genes. Primero, las regiones promotoras se reemplazaron con un promotor híbrido más eficiente que combinaba el promotor PL del fago lambda de E. coli (λ PL) con las secuencias operadoras del represor lac ( Lacl ) y del represor Tet ( TetR ). Segundo, para reducir la disparidad entre la vida media de las proteínas represoras y los ARNm, se añadió una etiqueta carboxi terminal basada en la secuencia de ARN ssrA en el extremo 3' de cada gen represor. Esta etiqueta es reconocida por proteasas que dirigen la proteína para su degradación. El diseño se implementó utilizando un plásmido de baja copia que codifica el represilador y un reportero de mayor copia, que se utilizaron para transformar un cultivo de E. coli .

Represiladores de origen natural

Plantas

Los circuitos circadianos en las plantas presentan un bucle de retroalimentación reguladora transcripcional llamado represilador. En el bucle oscilador central (delineado en gris) en A. thaliana , la luz es detectada primero por dos criptocromos y cinco fitocromos . Dos factores de transcripción, Circadian Clock Associated 1 (CCA1) y Late Elongated Hypocotyl (LHY), reprimen genes asociados con la expresión vespertina como Timing of CAB expression 1 ( TOC1 ) y activan genes asociados con la expresión matutina al unirse a sus promotores. TOC1 , un gen vespertino, regula positivamente a CCA1 y LHY a través de un mecanismo desconocido. [ 3 ] El factor de transcripción de fase vespertina CCA1 Hiking Expedition (CHE) y la histona desmetilasa jumonji C domain-containing 5 (JMJD5) reprimen directamente a CCA1 . Se ha descubierto que otros componentes se expresan a lo largo del día e inhiben o activan, directa o indirectamente, un elemento consecuente en el circuito circadiano, creando así una red compleja, robusta y flexible de bucles de retroalimentación. [ 3 ]

Expresión de la fase matutina

El bucle de expresión de la fase matutina se refiere a los genes y proteínas que regulan los ritmos durante el día en A. thaliana . Los dos genes principales son LHY y CCA1, que codifican los factores de transcripción LHY y CCA1. [ 4 ] Estas proteínas forman heterodímeros que entran al núcleo y se unen al promotor del gen TOC1 , reprimiendo la producción de la proteína TOC1. Cuando la proteína TOC1 se expresa, regula LHY y CCA1 mediante la inhibición de su transcripción. Esto fue respaldado posteriormente en 2012 por la Dra. Alexandra Pokhilo, quien utilizó análisis computacionales para demostrar que TOC1 desempeñaba esta función como inhibidor de la expresión de LHY y CCA1 . [ 5 ] El bucle matutino inhibe la elongación del hipocótilo , en contraste con el bucle de la fase vespertina, que la promueve. Se ha demostrado que el bucle de la fase matutina es incapaz de mantener la oscilación circadiana cuando se han mutado los genes de expresión de la fase vespertina, [ 5 ] lo que sugiere la interdependencia de cada componente en este represor que se produce de forma natural.    

Expresión de la fase vespertina

Early Flowering 3 ( ELF3 ), Early Flowering 4 ( ELF4 ) y Phytoclock1 ( LUX ) son elementos clave en la expresión de genes del reloj circadiano vespertino en A. thaliana. Forman el complejo vespertino, en el que LUX se une a los promotores de Phytochrome Interacting Factor 4 ( PIF4 ) y Phytochrome Interacting Factor 5 ( PIF5 ) y los inhibe. [ 3 ] Como resultado, la elongación del hipocótilo se reprime al anochecer. Cuando la inhibición se alivia a altas horas de la noche, el hipocótilo se elonga. La floración fotoperiódica está controlada por el gen de salida Gigantea ( GI ). GI se activa por la noche y activa la expresión de Constans ( CO ), que activa la expresión de Flowering Locus T ( FT ). FT provoca entonces la floración en días largos. [ 3 ]

Mamíferos

Los mamíferos desarrollaron un mecanismo de sincronización endógeno para coordinar tanto la fisiología como el comportamiento en el período de 24 horas. [ 6 ] En 2016, los investigadores identificaron una secuencia de tres inhibiciones subsiguientes dentro de este mecanismo que identificaron como un represor, que ahora se cree que sirve como un elemento central principal de esta red circadiana. La necesidad de este sistema se estableció a través de una serie de deleciones genéticas entre criptocromo ( Cry ), período ( Per ) y Rev-erb , genes centrales del reloj de los mamíferos cuyas deleciones conducen a arritmia. [ 6 ] El modelo que generaron estos investigadores incluye Bmal1 como impulsor de la transcripción mediada por E-box, Per2 y Cry1 como represores tempranos y tardíos de E-box , respectivamente, así como el regulador de D-box Dbp y el receptor nuclear Rev-erb-α . Las inhibiciones secuenciales de Rev-erb , Per y Cry1 pueden generar oscilaciones sostenidas, y al bloquear todos los demás componentes excepto este represor, las oscilaciones persistieron con amplitudes y períodos similares. [ 6 ] Todas las redes oscilantes parecen involucrar alguna combinación de estos tres genes centrales, como se demuestra en varios esquemas publicados por los investigadores.

Trabajos recientes

El modelo represilador se ha utilizado para modelar y estudiar otras vías y sistemas biológicos. Desde entonces, se ha realizado un extenso trabajo sobre las capacidades de modelado del represilador. En 2003, la representación y validación de modelos biológicos del represilador, un modelo con muchas variables, se llevó a cabo utilizando el sistema Simpathica, que verificó que el modelo efectivamente oscila con toda su complejidad.

Como se indica en el trabajo original de Elowitz y Leibler, el objetivo final de la investigación sobre represiladores es construir un reloj circadiano artificial que imite su contraparte natural y endógena. Esto implicaría desarrollar un reloj artificial con ruido reducido y compensación de temperatura para comprender mejor los ritmos circadianos presentes en todos los ámbitos de la vida. [ 7 ] La alteración de los ritmos circadianos puede provocar la pérdida de ritmicidad en los procesos metabólicos y transcripcionales , e incluso acelerar la aparición de ciertas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer . [ 8 ] En 2017, se crearon en un laboratorio osciladores que generaban ritmos circadianos y que no se veían muy afectados por la temperatura. [ 6 ]

Desde el punto de vista patológico , el modelo represilador puede utilizarse para modelar el crecimiento celular y las anomalías que puedan surgir, como las presentes en las células cancerosas . [ 9 ] De este modo, se podrían desarrollar nuevos tratamientos basados ​​en la actividad circadiana de las células cancerosas. Además, en 2016, un equipo de investigación mejoró el diseño previo del represilador. Tras un análisis de ruido (procesamiento de señales) , los autores trasladaron el constructo reportero GFP al plásmido represilador y eliminaron las etiquetas de degradación ssrA de cada proteína represora. Esto extendió el período y mejoró la regularidad de las oscilaciones del represilador. [ 10 ]

Significado

Biología sintética

Se descubrieron represores artificiales mediante la implantación de un bucle de inhibición sintético en E. coli . Esto representó la primera implementación de oscilaciones sintéticas en un organismo. Otras implicaciones de esto incluyen la posibilidad de rescatar componentes mutados de oscilaciones de forma sintética en organismos modelo. [ 7 ]

El represilador artificial es un hito de la biología sintética que demuestra que las redes reguladoras genéticas pueden diseñarse e implementarse para realizar funciones novedosas. Sin embargo, se descubrió que las oscilaciones de las células se desfasaban después de un tiempo y que la actividad del represilador artificial se veía influenciada por el crecimiento celular. El experimento inicial [ 7 ], por lo tanto, revalorizó el reloj circadiano presente en muchos organismos, ya que los represiladores endógenos son significativamente más robustos que los represiladores artificiales implantados. Nuevas investigaciones en el Centro de Biología Cuantitativa de RIKEN han descubierto que las modificaciones químicas de una sola molécula de proteína podrían formar un oscilador autosostenible e independiente de la temperatura. [ 11 ]

Los represores artificiales podrían potencialmente ayudar en la investigación y los tratamientos en campos que van desde la biología circadiana hasta la endocrinología. Cada vez son más capaces de demostrar la sincronización inherente a los sistemas biológicos naturales y los factores que los afectan. [ 12 ]

Biología circadiana

Una mejor comprensión del represilador natural en organismos modelo con ritmos circadianos endógenos, como A. thaliana, tiene aplicaciones en la agricultura, especialmente en lo que respecta al cultivo de plantas y la gestión del ganado. [ 13 ]

Referencias

  1. ^ Oliveira, Samuel MD; Chandraseelan, Jerome G.; Häkkinen, Antti; Gonçalves, Nadia SM; Yli-Harja, Olli; Startceva, Sofía; Ribeiro, André S. (2015). "Cinética unicelular de un represilador cuando se implementa en un plásmido de copia única". Mol. BioSistema . 11 (7): 1939-1945 . doi : 10.1039/c5mb00012b . PMID 25923804 . 
  2. ↑ Stanislas Leibler; Elowitz, Michael B. (2000-01-20). "Una red oscilatoria sintética de reguladores transcripcionales". Nature . 403 (6767): 335– 338. Bibcode : 2000Natur.403..335E . doi : 10.1038/35002125 . ISSN 1476-4687 . PMID 10659856 . S2CID 41632754 .   
  3. 1 2 3 4 Kay, Steve A.; Nagel, Dawn H. (2012-08-21). "Complejidad en el cableado y la regulación de las redes circadianas de las plantas" . Current Biology . 22 (16): R648– R657. doi : 10.1016/j.cub.2012.07.025 . ISSN 0960-9822 . PMC 3427731. PMID 22917516 .   
  4. ↑ Hsu, Polly Yingshan; Harmer, Stacey L. (Primavera de 2014). "Ruedas dentro de ruedas: el sistema circadiano de las plantas" . Trends in Plant Science . 19 (4): 240– 249. doi : 10.1016/j.tplants.2013.11.007 . ISSN 1360-1385 . PMC 3976767. PMID 24373845 .   
  5. 1 2 Pokhilko, Alexandra; Fernández, Aurora Piñas; Edwards, Kieron D; Southern, Megan M; Halliday, Karen J; Millar, Andrew J (2012-03-13). "El circuito del gen del reloj en Arabidopsis incluye un represilador con bucles de retroalimentación adicionales" . Biología de Sistemas Moleculares . 8 : 574. doi : 10.1038/msb.2012.6 . ISSN 1744-4292 . PMC 3321525. PMID 22395476 .   
  6. 1 2 3 4 Wu, Lili; Ouyang, Qi; Wang, Hongli (2017-02-02). "Topologías de red robustas para generar oscilaciones con períodos independientes de la temperatura" . PLOS ONE . 12 (2) e0171263. Bibcode : 2017PLoSO..1271263W . doi : 10.1371/journal.pone.0171263 . ISSN 1932-6203 . PMC 5289577. PMID 28152061 .   
  7. 1 2 3 Una red oscilatoria sintética de reguladores transcripcionales; Michael Elowitz y Stanislas Leibler ; Nature. 2000 20 de enero;403(6767):335-8.
  8. ^ Homolak, enero; Mudrovcic, Monika; Vukić, Barbara; Toljan, Karlo (21 de junio de 2018). "Ritmo circadiano y enfermedad de Alzheimer" . Ciencias Médicas . 6 (3): 52. doi : 10.3390/medsci6030052 . ISSN 2076-3271 . PMC 6164904 . PMID 29933646 .   
  9. ↑ Szymańska, Zuzanna; Cytowski, Maciej; Mitchell, Elaine; Macnamara, Cicely K.; Chaplain, Mark AJ (mayo de 2018). "Modelado computacional del desarrollo y crecimiento del cáncer: modelado a múltiples escalas y modelado multiescala" (PDF) . Boletín de Biología Matemática . 80 (5): 1366– 1403. doi : 10.1007/s11538-017-0292-3 . hdl : 10023/14364 . ISSN 1522-9602 . PMID 28634857. S2CID 4009271 .   
  10. ↑ Potvin-Trottier, Laurent; Lord, Nathan D.; Vinnicombe, Glenn; Paulsson, Johan (27-10-2016). "Oscilaciones sincrónicas a largo plazo en un circuito genético sintético" . Nature . 538 ( 7626): 514– 517. Bibcode : 2016Natur.538..514P . doi : 10.1038/nature19841 . PMC 5637407. PMID 27732583 .  
  11. ↑ Jolley, Craig C.; Ode, Koji L.; Ueda, Hiroki R. (2012). "Un principio de diseño para un oscilador bioquímico postraduccional" . Cell Reports . 2 (4): 938– 950. doi : 10.1016/j.celrep.2012.09.006 . ISSN 2211-1247 . PMID 23084745 .  
  12. ↑ Garcia-Ojalvo, Jordi; Elowitz, Michael B.; Strogatz, Steven H. (2004-07-27). "Modelado de un reloj multicelular sintético: represiladores acoplados por detección de quórum" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 101 (30): 10955– 10960. Bibcode : 2004PNAS..10110955G . doi : 10.1073/pnas.0307095101 . ISSN 0027-8424 . PMC 503725. PMID 15256602 .   
  13. ↑ Gottlieb, Daphna (29 de junio de 2019). "Agrocronobiología: Integración de los relojes circadianos/biología del tiempo en la gestión del almacenamiento". Journal of Stored Products Research . 82 : 9–16 . doi : 10.1016/j.jspr.2019.03.003 . ISSN 0022-474X . S2CID 109800308 .  
    • Enlace directo al modelo del represilador y una descripción en la base de datos BioModels.
    • Una simulación del represilador en R: https://gist.github.com/AndreyAkinshin/37f3e68a1576f9ea1e5c01f2fd64fe5e
    • Simulación en línea del represilador: https://www.yschaerli.com/repressilator.html
    • Diagrama del sistema de bucles de retroalimentación en A. thaliana
    • Enlace directo a información sobre el gen CCA1 y el papel que desempeña en A. thaliana.