Crítica al promotor

La técnica de manipulación de promotores se utiliza en biología molecular para identificar cómo ciertas regiones de una cadena de ADN , comúnmente promotores , afectan la transcripción de genes posteriores. En circunstancias normales, las proteínas se unen al promotor y activan o reprimen la transcripción. En un ensayo de manipulación de promotores, se realizan mutaciones puntuales o deleciones específicas en regiones concretas del promotor y, posteriormente, se mide la transcripción del gen. La contribución de una región del promotor se puede observar mediante el nivel de transcripción. Si una mutación o deleción modifica el nivel de transcripción, se sabe que esa región del promotor puede ser un sitio de unión u otro elemento regulador. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}

La manipulación de promotores se suele realizar mediante deleciones en los extremos 5' o 3' de la cadena de ADN; este ensayo es más fácil de llevar a cabo mediante digestión repetida con enzimas de restricción y purificación en gel de fragmentos de tamaños específicos. Generalmente, lo más sencillo es ligar el promotor al gen reportero, generar una gran cantidad de este último mediante PCR o cultivo bacteriano, y luego realizar digestiones seriadas con enzimas de restricción en esta muestra. La capacidad de los promotores corriente arriba se puede evaluar fácilmente eliminando segmentos del extremo 5', y lo mismo ocurre con el extremo 3' de la cadena para los promotores corriente abajo. ^{[ 4 ]}

Dado que los promotores suelen contener secuencias de unión para proteínas que regulan la transcripción, estas proteínas también son esenciales para evaluar la función del promotor. Las proteínas que se asocian al promotor pueden identificarse mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA), y los efectos de la inclusión o exclusión de las proteínas con los promotores mutagenizados pueden evaluarse en dicho ensayo. Esto permite utilizar la técnica de manipulación de promotores para descubrir no solo la ubicación en la cadena de ADN que afecta la transcripción, sino también las proteínas que afectan a esa cadena. Los efectos de las interacciones entre proteínas, así como los de los sitios de unión, también pueden evaluarse de esta manera; las proteínas candidatas deben identificarse mediante ensayos de interacción proteína-proteína en lugar de un EMSA. ^{[ 5 ]}

Este es un ejemplo de procedimiento para un ensayo de ataque de promotor, adaptado de Boulin et al .: ^{[ 6 ]}

1. Clonar la región de ADN que se cree que actúa como promotor. La clonación es necesaria para el ensayo porque garantiza que el promotor sea el único factor que afecta la expresión. Este paso suele implicar la extracción del ADN del organismo en el que se encuentra y su amplificación mediante PCR .
2. Secuenciar la región. La secuenciación del ADN es necesaria para identificar las diferencias entre los promotores mutados y el promotor de tipo silvestre, y para correlacionar dichas diferencias con las variaciones en la expresión génica. Además, facilita la digestión con enzimas de restricción de la región.
3. Digerir con las endonucleasas de restricción adecuadas. La región puede digerirse para eliminar elementos que se consideran ajenos al promotor. Además, en la mayoría de los casos, el gen reportero debe insertarse a una distancia determinada del promotor. En algunos métodos de manipulación del promotor, se utilizan múltiples digestiones con enzimas de restricción para eliminar sistemáticamente elementos del promotor; este método garantiza que las regiones del promotor eliminadas no contribuyan a la expresión del gen reportero .
4. Mutagenizar el promotor. Mutar el promotor es necesario si no se utiliza el método de eliminación parcial del promotor mediante digestión con enzimas de restricción. Se pueden generar múltiples cadenas mutadas, secuenciarlas y analizar la actividad de los promotores. Esto suele ser necesario porque no se puede garantizar que una sola mutación inactive un sitio de unión. También se puede utilizar la mutagénesis no dirigida basada en PCR; los parámetros de la reacción de PCR mutagénica se pueden ajustar para introducir un número razonable de mutaciones. Sin embargo, la naturaleza aleatoria de la PCR requiere que se analicen más cadenas después de este paso.
5. Ligar al gen reportero. Los promotores que se van a analizar deben ligarse a un gen reportero para poder medir los niveles de expresión génica. El gen reportero debe estar a una distancia suficiente del promotor para que este lo afecte como lo haría un promotor de tipo silvestre. Esto se puede verificar con el control positivo (promotor completo).
6. Transforme las células de interés con los distintos constructos promotor -reportero. Estos constructos deben ligarse a un plásmido y transformarse en células que puedan expresar dicho plásmido para medir la actividad de cada secuencia promotora. También deben añadirse a estas células proteínas que afectan al promotor; a menudo, dichas proteínas se colocan en el mismo plásmido o en uno diferente, bajo la regulación de un promotor constitutivamente activo.
7. Medir las tasas de transcripción del gen reportero. Se analizan los productos génicos y se miden las tasas de transcripción del gen reportero.

A partir de los datos obtenidos al analizar los diferentes promotores, se pueden determinar los efectos de distintas partes del promotor. Sin embargo, es posible que no se disponga de datos suficientes y que sea necesario repetir el análisis con una región promotora diferente o con mutaciones distintas.

• Mutagénesis dirigida al sitio
• digestión de restricción
• Huella genética