elemento P

Los elementos P son elementos transponibles que se descubrieron en Drosophila como agentes causantes de rasgos genéticos denominados disgenesia híbrida . El transposón es responsable del rasgo P del elemento P y se encuentra únicamente en moscas silvestres. También se encuentran en muchos otros eucariotas. ^{[ 1 ]}

El nombre fue sugerido por primera vez por la bióloga evolutiva Margaret Kidwell , quien, junto con James Kidwell y John Sved, investigó la disgenesia híbrida en Drosophila . Se referían a las cepas como P de paternas y M de maternas si contribuían a la disgenesia híbrida en esta función reproductiva. ^{[ 2 ]}

El elemento P codifica una enzima conocida como transposasa P. A diferencia de las hembras criadas en laboratorio, se cree que las hembras silvestres también expresan un inhibidor de la función de la transposasa P , producido por el mismo elemento. Este inhibidor reduce la alteración del genoma causada por el movimiento de los elementos P , lo que permite la fertilidad de la descendencia. La evidencia de esto proviene de cruces entre hembras de laboratorio (que carecen del inhibidor de la transposasa P ) y machos silvestres (que poseen elementos P ). En ausencia del inhibidor, los elementos P pueden proliferar por todo el genoma, alterando muchos genes y, a menudo, resultando letales para la descendencia o provocando su esterilidad.

Los elementos P se utilizan comúnmente como agentes mutagénicos en experimentos genéticos con Drosophila . Una ventaja de este método es que las mutaciones son fáciles de localizar. En la disgenesia híbrida, una cepa de Drosophila se aparea con otra , produciendo descendencia híbrida y causando daño cromosómico conocido como disgenesia. La disgenesia híbrida requiere la contribución de ambos progenitores. Por ejemplo, en el sistema PM , donde la cepa P contribuye paternamente y la cepa M contribuye maternamente, puede ocurrir disgenesia. El cruce inverso, con un padre de citotipo M y una madre P , produce descendencia normal, ya que se cruza de manera P x P o M x M. Los cromosomas masculinos P pueden causar disgenesia cuando se cruzan con una hembra M.

El elemento P es un transposón de clase II y se mueve mediante un mecanismo de "corte y pegado" basado en ADN. La secuencia de reconocimiento comprende cuatro exones separados por tres intrones . ^{[ 3 ]} El empalme completo de los intrones produce la enzima transposasa, mientras que el empalme parcial alternativo de los intrones 1 y 2, dejando solo el intrón 3 en el transcrito de ARNm, codifica el represor del elemento P. El elemento P completo y autónomo codifica una enzima transposasa, que reconoce las repeticiones invertidas terminales de 31 pb en cada extremo del elemento P y cataliza la escisión y reinserción del elemento P. El elemento completo tiene una longitud de 2907 pb; los elementos P no autónomos contienen una deleción interna de longitud variable que anula la producción de transposasa, pero dichos elementos aún pueden movilizarse si una transposasa funcional está codificada en otra parte del genoma. La inserción del elemento P y su posterior escisión dejan necesariamente repeticiones directas de 8 pares de bases en el sitio de escisión; por lo tanto, la presencia de dichas repeticiones es indicativa de actividad previa del elemento P.

Todos los elementos P poseen una estructura canónica que contiene repeticiones invertidas terminales de 31 pb y repeticiones invertidas internas de 11 pb ubicadas en el dominio THAP de la transposasa. Los elementos P más cortos y más largos son elementos no autónomos. Los elementos P más largos codifican la transposasa necesaria para la transposición. La misma secuencia que codifica la transposasa también codifica un supresor de la transposición, que se acumula en el citoplasma durante el desarrollo celular. Por lo tanto, en un cruce entre un macho P o M y una hembra P , el citoplasma de la hembra contiene el supresor, que se une a cualquier elemento P e impide su transposición.

La disgenesia híbrida se refiere a la alta tasa de mutación en las células germinales de cepas de Drosophila resultantes del cruce entre machos con elementos P autónomos ( cepa P / citotipo P ) y hembras que carecen de elementos P ( cepa M /citotipo M ). El síndrome de disgenesia híbrida se caracteriza por esterilidad dependiente de la temperatura, tasas de mutación elevadas y un aumento en la reorganización y recombinación cromosómica.

El fenotipo de disgenesia híbrida se ve afectado por la transposición de elementos P dentro de las células germinales de la descendencia de machos de la cepa P con hembras de la cepa M. La transposición solo ocurre en las células germinales, ya que el proceso de empalme necesario para la síntesis del ARNm de la transposasa no se produce en las células somáticas.

La disgenesia híbrida se manifiesta al cruzar machos de la cepa P con hembras de la cepa M , pero no al cruzar hembras de la cepa P (hembras con elementos P autónomos ) con machos de la cepa M. Los óvulos de las hembras de la cepa P contienen altas cantidades de una proteína represora que impide la transcripción del gen de la transposasa. Los óvulos de las madres de la cepa M , que no contienen la proteína represora, permiten la transposición de elementos P del esperma de los padres. En las hembras de la cepa P , los represores se encuentran en el citoplasma. Por lo tanto, cuando los machos de la cepa P fertilizan a las hembras de la cepa M (cuyo citoplasma no contiene represor), el macho aporta su genoma con el elemento P , pero no su citoplasma, lo que da lugar a descendencia de la cepa P. ^{[ 3 ]}

Este efecto contribuye a que los piRNAs se hereden solo en la línea materna, lo que proporciona un mecanismo de defensa contra los elementos P. ^{[ 4 ]}

El elemento P se ha utilizado ampliamente en la investigación con Drosophila como mutágeno. El sistema de mutagénesis suele emplear un elemento autónomo pero inmóvil y un elemento móvil no autónomo. Las moscas de generaciones posteriores pueden analizarse mediante fenotipo o PCR . Los elementos P naturales contienen la secuencia codificante de la enzima transposasa y secuencias de reconocimiento para su acción. La transposasa regula y cataliza la escisión del elemento P del ADN del huésped, cortando en los dos sitios de reconocimiento y reinsertándolo aleatoriamente. Esta inserción aleatoria, que puede interferir con genes existentes o contener un gen adicional, puede utilizarse para la investigación genética.

Para utilizar esto como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar la transposición incontrolada. Las herramientas genéticas habituales son ADN que codifica la transposasa sin secuencias de reconocimiento de transposasa para que no pueda insertarse y un " plásmido P ". Los plásmidos P siempre contienen un gen reportero de Drosophila , a menudo un marcador de ojos rojos (producto del gen blanco ) y secuencias de reconocimiento de transposasa. Pueden contener un gen de interés, un gen marcador seleccionable de E. coli , a menudo algún tipo de resistencia a antibióticos , un origen de replicación u otras secuencias de mantenimiento del plásmido asociadas .

Existen dos formas principales de utilizar estas herramientas:

1. Clonar el elemento P en un plásmido, transformarlo en bacterias y cultivarlo.
2. Elimine la transposasa P y sustitúyala por el gen de su interés.
3. Microinyectar en el extremo posterior de un embrión en etapa temprana (precelularización) ADN que codifica la transposasa y un plásmido con el gen reportero, el gen de interés y las secuencias de reconocimiento de la transposasa.
4. Se produce una transposición aleatoria, insertando el gen de interés y el gen reportero.
5. Una vez insertado el gen de interés, este deja de ser móvil porque no puede producir su propia transposasa P.
6. Cultiva moscas y crúzalas para eliminar la variación genética entre las células del organismo. (Solo algunas de las células del organismo se habrán transformado. Idealmente, algunas de estas células transformadas llegarán a la línea germinal. Un gameto transformado dará lugar a un organismo sin variación entre sus células).
7. Busque moscas que expresen el gen reportero. Estas portan el gen de interés insertado, por lo que pueden ser investigadas para determinar el fenotipo debido a dicho gen.

Es posible que el gen insertado haya dañado la función de uno de los genes del huésped. Se requieren varias líneas de moscas para poder realizar la comparación y asegurar que no se hayan inactivado genes adicionales.

1. Microinyectar en el embrión ADN que codifica la transposasa y un plásmido con el gen reportero y las secuencias de reconocimiento de la transposasa (y a menudo el gen reportero de E. coli y el origen de replicación, etc.).
2. La transposición aleatoria consiste en la inserción aleatoria del gen reportero. Esta inserción tiende a ocurrir cerca de genes que se transcriben activamente, ya que es allí donde la estructura de la cromatina es más laxa, lo que hace que el ADN sea más accesible.
3. Cultivar moscas y cruzarlas para eliminar la variación genética entre las células del organismo (véase más arriba).
4. Busque moscas que expresen el gen reportero. Estas han experimentado una transposición exitosa, por lo que pueden investigarse para determinar el fenotipo debido a la mutación de genes existentes.

Posibles mutaciones:

1. Inserción en una región traducida => proteína híbrida/proteína truncada. Generalmente causa pérdida de la función proteica, aunque se observan efectos más complejos.
2. La inserción en un intrón provoca una alteración en el patrón de empalme o un fallo en el mismo. Generalmente, esto resulta en la truncación de la proteína o en la producción de productos de empalme incorrectos inactivos, aunque son comunes efectos más complejos.
3. La inserción en la región no traducida 5' (la secuencia que se convertirá en la región 5' UTR del ARNm) provoca el truncamiento del transcrito. Esto suele resultar en que el ARNm no contenga una caperuza 5' , lo que conlleva una traducción menos eficiente.
4. Inserción en el promotor => reducción/pérdida total de la expresión. Siempre resulta en niveles de producción de proteína muy reducidos. Es el tipo de inserción más útil para el análisis debido a la simplicidad de la situación.
5. Inserción entre el promotor y los potenciadores corriente arriba => pérdida de la función del potenciador/apropiación indebida de la función del potenciador para el gen reportero.† Generalmente reduce el nivel de especificidad de la proteína para el tipo de célula, aunque a menudo se observan efectos complejos.

El secuestro de un potenciador de otro gen permite analizar la función de dicho potenciador. Esto, especialmente si el gen reportero codifica una proteína fluorescente, puede utilizarse para mapear la expresión del gen mutado en el organismo, y constituye una herramienta muy potente. Es una herramienta útil para observar los patrones de expresión génica (temporal y espacialmente).

Estos métodos se conocen como genética inversa. La genética inversa es un método para descubrir la función de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos de secuencias genéticas específicas obtenidas mediante secuenciación de ADN.

Una vez determinada la función de la proteína mutada, es posible secuenciar/purificar/clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:

1. Aislar el genoma de la mosca.
2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] que se sabe que NO corta en el gen reportero), dando fragmentos de unos pocos kilobases, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
3. Autoliga el fragmento digerido (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando como resultado una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
4. Cortar los plásmidos en algún punto del gen reportero (con una enzima [enzima 2] que se sabe que corta muy raramente en el ADN genómico, pero que se sabe que lo hace en el gen reportero).
5. Utilizando cebadores para las secciones del gen reportero, el ADN puede amplificarse para su secuenciación .

El proceso de corte, autoligación y nuevo corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto donde se produjo la ligación se puede observar identificando el sitio de corte de la enzima 1.

1. Aislar el genoma de la mosca.
2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] conocida por cortar en el límite entre el gen reportero y las secuencias del gen reportero y del plásmido de E. coli ), dando fragmentos de unos pocos kilobases, algunos con el gen reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
3. Autoligar el extracto digerido (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando como resultado una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con el reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
4. Insertar los plásmidos en células de E. coli (por ejemplo, mediante electroporación).
5. Seleccione plásmidos que contengan el gen marcador seleccionable de E. coli . Solo los plásmidos insertados correctamente que contengan las secuencias de mantenimiento celular expresarán este gen.
6. El gen puede clonarse para su posterior análisis.

• Leland Hartwell et al., 2004. Genética: De los genes a los genomas, 2.ª ed. McGraw-Hill.
• Engels, WR Elementos P en Drosophila

• FlyBase archivado el 3 de noviembre de 2006 en Wayback Machine.