elemento P

Los elementos P son elementos transponibles que se descubrieron en Drosophila como agentes causantes de rasgos genéticos denominados disgenesia híbrida . El transposón es responsable del rasgo P del elemento P y se encuentra únicamente en moscas silvestres. También se encuentran en muchos otros eucariotas. ^{[ 1 ]}

El nombre fue sugerido por primera vez por la bióloga evolutiva Margaret Kidwell , quien, junto con James Kidwell y John Sved, investigó la disgenesia híbrida en Drosophila . Se referían a las cepas como P de paternas y M de maternas si contribuían a la disgenesia híbrida en esta función reproductiva. ^{[ 2 ]}

El elemento P codifica una enzima conocida como transposasa P. A diferencia de las hembras criadas en laboratorio, se cree que las hembras silvestres también expresan un inhibidor de la función de la transposasa P , producido por el mismo elemento. Este inhibidor reduce la alteración del genoma causada por el movimiento de los elementos P , lo que permite la fertilidad de la descendencia. La evidencia de esto proviene de cruces entre hembras de laboratorio (que carecen del inhibidor de la transposasa P ) y machos silvestres (que poseen elementos P ). En ausencia del inhibidor, los elementos P pueden proliferar por todo el genoma, alterando muchos genes y, a menudo, resultando letales para la descendencia o provocando su esterilidad.

Los elementos P se utilizan comúnmente como agentes mutagénicos en experimentos genéticos con Drosophila . Una ventaja de este método es que las mutaciones son fáciles de localizar. En la disgenesia híbrida, una cepa de Drosophila se aparea con otra , produciendo descendencia híbrida y causando daño cromosómico conocido como disgenesia. La disgenesia híbrida requiere la contribución de ambos progenitores. Por ejemplo, en el sistema PM , donde la cepa P contribuye paternamente y la cepa M contribuye maternamente, puede ocurrir disgenesia. El cruce inverso, con un padre de citotipo M y una madre P , produce descendencia normal, ya que se cruza de manera P x P o M x M. Los cromosomas masculinos P pueden causar disgenesia cuando se cruzan con una hembra M.

El elemento P es un transposón de clase II y se mueve mediante un mecanismo de "corte y pegado" basado en ADN. La secuencia de reconocimiento comprende cuatro exones separados por tres intrones . ^{[ 3 ]} El empalme completo de los intrones produce la enzima transposasa, mientras que el empalme parcial alternativo de los intrones 1 y 2, dejando solo el intrón 3 en el transcrito de ARNm, codifica el represor del elemento P. El elemento P completo y autónomo codifica una enzima transposasa, que reconoce las repeticiones invertidas terminales de 31 pb en cada extremo del elemento P y cataliza la escisión y reinserción del elemento P. El elemento completo tiene una longitud de 2907 pb; los elementos P no autónomos contienen una deleción interna de longitud variable que anula la producción de transposasa, pero dichos elementos aún pueden movilizarse si una transposasa funcional está codificada en otra parte del genoma. La inserción del elemento P y su posterior escisión dejan necesariamente repeticiones directas de 8 pares de bases en el sitio de escisión; por lo tanto, la presencia de dichas repeticiones es indicativa de actividad previa del elemento P.

Todos los elementos P poseen una estructura canónica que contiene repeticiones invertidas terminales de 31 pb y repeticiones invertidas internas de 11 pb ubicadas en el dominio THAP de la transposasa. Los elementos P más cortos y más largos son elementos no autónomos. Los elementos P más largos codifican la transposasa necesaria para la transposición. La misma secuencia que codifica la transposasa también codifica un supresor de la transposición, que se acumula en el citoplasma durante el desarrollo celular. Por lo tanto, en un cruce entre un macho P o M y una hembra P , el citoplasma de la hembra contiene el supresor, que se une a cualquier elemento P e impide su transposición.

La disgenesia híbrida se refiere a la alta tasa de mutación en las células germinales de cepas de Drosophila resultantes del cruce entre machos con elementos P autónomos ( cepa P / citotipo P ) y hembras que carecen de elementos P ( cepa M /citotipo M ). El síndrome de disgenesia híbrida se caracteriza por esterilidad dependiente de la temperatura, tasas de mutación elevadas y un aumento en la reorganización y recombinación cromosómica.

The hybrid dysgenesis phenotype is affected by the transposition of P elements within the germ-line cells of offspring of P strain males with M strain females. Transposition only occurs in germ-line cells, because a splicing event needed to make transposasemRNA does not occur in somatic cells.

Hybrid dysgenesis manifests when crossing P strain males with M strain females and not when crossing P strain females (females with autonomous P elements) with M strain males. The eggs of P strain females contain high amounts of a repressor protein that prevents transcription of the transposase gene. The eggs of M strain mothers, which do not contain the repressor protein, allow for transposition of P elements from the sperm of fathers. In P strain females, the repressors are found in the cytoplasm. Hence, when P strain males fertilize M strain females (whose cytoplasm contain no repressor), the male contributes its genome with the P element but not the male cytoplasm leading to P strain progeny.^[3]

This effect contributes to piRNAs being inherited only in the maternal line, which provides a defense mechanism against P elements.^[4]

The P element has found wide use in Drosophila research as a mutagen. The mutagenesis system typically uses an autonomous but immobile element, and a mobile nonautonomous element. Flies from subsequent generations can then be screened by phenotype or PCR. Naturally-occurring P elements contain coding sequence for the enzyme transposase and recognition sequences for transposase action. Transposase regulates and catalyzes the excision of a P element from the host DNA, cutting at the two recognition sites, and then reinserting randomly. It is the random insertion that may interfere with existing genes, or carry an additional gene, that can be used for genetic research.

Para utilizar esto como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar la transposición incontrolada. Las herramientas genéticas habituales son ADN que codifica la transposasa sin secuencias de reconocimiento de transposasa para que no pueda insertarse y un " plásmido P ". Los plásmidos P siempre contienen un gen reportero de Drosophila , a menudo un marcador de ojos rojos (producto del gen blanco ) y secuencias de reconocimiento de transposasa. Pueden contener un gen de interés, un gen marcador seleccionable de E. coli , a menudo algún tipo de resistencia a antibióticos , un origen de replicación u otras secuencias de mantenimiento del plásmido asociadas .

Análisis de productos de mutagénesis

Una vez determinada la función de la proteína mutada, es posible secuenciar/purificar/clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:

PCR inversa

1. Aislar el genoma de la mosca.
2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] que se sabe que NO corta en el gen reportero), dando fragmentos de unos pocos kilobases, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
3. Autoliga el fragmento digerido (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando como resultado una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
4. Cortar los plásmidos en algún punto del gen reportero (con una enzima [enzima 2] que se sabe que corta muy raramente en el ADN genómico, pero que se sabe que lo hace en el gen reportero).
5. Utilizando cebadores para las secciones del gen reportero, el ADN puede amplificarse para su secuenciación .

El proceso de corte, autoligación y nuevo corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto donde se produjo la ligación se puede observar identificando el sitio de corte de la enzima 1.

Rescate de plásmidos

1. Aislar el genoma de la mosca.
2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] conocida por cortar en el límite entre el gen reportero y las secuencias del gen reportero y del plásmido de E. coli ), dando fragmentos de unos pocos kilobases, algunos con el gen reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
3. Autoligar el extracto digerido (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando como resultado una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con el reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
4. Insertar los plásmidos en células de E. coli (por ejemplo, mediante electroporación).
5. Seleccione plásmidos que contengan el gen marcador seleccionable de E. coli . Solo los plásmidos insertados correctamente que contengan las secuencias de mantenimiento celular expresarán este gen.
6. El gen puede clonarse para su posterior análisis.

• Leland Hartwell et al., 2004. Genética: De los genes a los genomas, 2.ª ed. McGraw-Hill.
• Engels, WR Elementos P en Drosophila

• FlyBase archivado el 3 de noviembre de 2006 en Wayback Machine.