Amplificación de sondas dependiente de ligación multiplex

La amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple ( MLPA ) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa múltiple que permite la amplificación de múltiples dianas con un único par de cebadores . ^{[ 1 ]} Detecta cambios en el número de copias a nivel molecular y se utilizan programas informáticos para su análisis. La identificación de deleciones o duplicaciones puede indicar mutaciones patógenas; por lo tanto, la MLPA es una herramienta diagnóstica importante utilizada en laboratorios de patología clínica en todo el mundo.

La amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple (MLPA) fue inventada por Jan Schouten , un científico neerlandés. ^{[ 1 ]} El método se describió por primera vez en 2002 en la revista científica Nucleic Acid Research . ^{[ 2 ]} Las primeras aplicaciones incluyeron la detección de deleciones de exones en los genes humanos BRCA1 , MSH2 y MLH1 , que están relacionados con el cáncer de mama y de colon hereditario. Actualmente, la MLPA se utiliza para detectar cientos de trastornos hereditarios, así como para la caracterización de tumores.

MLPA cuantifica la presencia de secuencias particulares en una muestra de ADN, utilizando un par de sondas especialmente diseñadas para cada secuencia diana de interés. El proceso consta de varios pasos: ^{[ 3 ]}

1. El ADN de la muestra se desnaturaliza , lo que da como resultado un ADN de muestra monocatenario.
2. Se hibridan pares de sondas al ADN de la muestra, y cada par de sondas está diseñado para detectar la presencia de una secuencia de ADN específica.
3. La ligasa se aplica al ADN hibridado, combinando pares de sondas que se hibridan inmediatamente una al lado de la otra para formar una sola hebra de ADN que puede amplificarse mediante PCR.
4. La PCR amplifica todos los pares de sondas que se han ligado correctamente, utilizando cebadores de PCR marcados con fluorescencia.
5. Los productos de PCR se cuantifican, normalmente mediante electroforesis (capilar) .

Cada par de sondas consta de dos oligonucleótidos, con una secuencia que reconoce sitios adyacentes del ADN diana , un sitio de cebado de PCR y, opcionalmente, un fragmento de relleno para dar al producto de PCR una longitud única en comparación con otros pares de sondas en el ensayo MLPA. Cada par de sondas completo debe tener una longitud única, de modo que sus amplicones resultantes puedan identificarse de forma unívoca durante la cuantificación, evitando las limitaciones de resolución de la PCR múltiple . Dado que el cebador directo utilizado para la amplificación de la sonda está marcado con fluorescencia , cada amplicón genera un pico fluorescente que puede detectarse mediante un secuenciador capilar. Comparando el patrón de picos obtenido en una muestra determinada con el obtenido en varias muestras de referencia, se puede determinar la cantidad relativa de cada amplicón. Esta proporción es una medida de la proporción en la que la secuencia diana está presente en el ADN de la muestra.

Diversas técnicas, como la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE ), la cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC ) y el análisis de conformación de cadena simple (SSCA), identifican eficazmente los SNP y las pequeñas inserciones y deleciones. Sin embargo, la MLPA es una de las pocas técnicas precisas y rápidas para detectar deleciones e inserciones genómicas (uno o más exones completos), que son causas frecuentes de cánceres como el cáncer colorrectal hereditario no polipósico ( HNPCC ), el cáncer de mama y el cáncer de ovario. La MLPA puede determinar con éxito y facilidad el número de copias relativas de todos los exones dentro de un gen simultáneamente con alta sensibilidad.

Una aplicación importante de MLPA es la determinación de la ploidía relativa . Por ejemplo, se pueden diseñar sondas para analizar diversas regiones del cromosoma 21 de una célula humana. La intensidad de la señal de las sondas se compara con la obtenida de una muestra de ADN de referencia que contiene dos copias del cromosoma. Si la muestra contiene una copia adicional, se espera que la intensidad de la señal sea 1,5 veces mayor que la de las sondas de referencia. Si solo hay una copia, la proporción esperada es de 0,5. Si la muestra contiene dos copias, se espera que la intensidad relativa de las sondas sea igual.

El análisis del cociente de dosis es el método habitual para interpretar los datos de MLPA. ^{[ 4 ]} Si a y b son las señales de dos amplicones en la muestra del paciente, y A y B son los amplicones correspondientes en el control experimental, entonces el cociente de dosis DQ = (a/b) / (A/B). Aunque los cocientes de dosis pueden calcularse para cualquier par de amplicones, normalmente uno de ellos es una sonda de referencia interna.

La técnica MLPA facilita la amplificación y detección de múltiples secuencias con un único par de cebadores. En una reacción de PCR múltiple estándar, cada fragmento requiere un par de cebadores de amplificación específico. La presencia de estos cebadores en grandes cantidades genera diversos problemas, como la dimerización y la amplificación inespecífica. Con MLPA, se puede lograr la amplificación de sondas. De esta forma, se pueden amplificar y cuantificar numerosas secuencias (hasta 40) utilizando un solo par de cebadores. La reacción MLPA es rápida, económica y muy sencilla de realizar.

MLPA tiene diversas aplicaciones ^{[ 5 ]} incluyendo la detección de mutaciones y polimorfismos de un solo nucleótido , ^{[ 6 ]} el análisis de la metilación del ADN , ^{[ 7 ]} la cuantificación relativa de ARNm , ^{[ 8 ]} la caracterización cromosómica de líneas celulares y muestras de tejido, ^{[ 9 ]} la detección del número de copias de genes, ^{[ 10 ]} la detección de duplicaciones y deleciones en genes de predisposición al cáncer humano como BRCA1 , BRCA2 , hMLH1 y hMSH2 ^{[ 11 ]} y la determinación de aneuploidía . ^{[ 12 ]} MLPA tiene una aplicación potencial en el diagnóstico prenatal, tanto invasivo ^{[ 13 ]} como no invasivo . ^{[ 14 ]}

Estudios recientes han demostrado que MLPA (así como otras variantes como iMLPA) es una técnica robusta para la caracterización de la inversión. ^{[ 15 ]}

• Otras aplicaciones de MLPA