Microscopía intravital

La microscopía intravital es una forma de microscopía que permite observar procesos biológicos en animales vivos ( in vivo ) a una alta resolución que hace posible distinguir entre células individuales de un tejido . ^[1]

En los mamíferos , en algunos entornos experimentales se realiza una implantación quirúrgica de una ventana de imágenes antes de la microscopía intravital. Esto permite observaciones repetidas durante varios días o semanas. Por ejemplo, si los investigadores quieren visualizar células hepáticas de un ratón vivo , implantarán una ventana de imágenes en el abdomen del ratón . ^[2] Los ratones son la elección más común de animales para la microscopía intravital, pero en casos especiales otros roedores como las ratas pueden ser más adecuados. Los animales suelen estar anestesiados durante las cirugías y las sesiones de imágenes. La microscopía intravital se utiliza en varias áreas de investigación, incluidas la neurología , la inmunología , los estudios de células madre y otros. Esta técnica es particularmente útil para evaluar la progresión de una enfermedad o el efecto de un fármaco. ^[1]

La microscopía intravital implica la obtención de imágenes de células de un animal vivo a través de una ventana de obtención de imágenes que se implanta en el tejido animal durante una cirugía especial. La principal ventaja de la microscopía intravital es que permite obtener imágenes de células vivas mientras se encuentran en el entorno real de un organismo multicelular complejo . Por lo tanto, la microscopía intravital permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las células en su entorno natural o in vivo en lugar de en un cultivo celular . Otra ventaja de la microscopía intravital es que el experimento se puede configurar de manera que permita observar cambios en un tejido vivo de un organismo durante un período de tiempo. Esto es útil para muchas áreas de investigación, incluida la inmunología ^[3] y la investigación con células madre. ^[1]
La alta calidad de los microscopios modernos y el software de obtención de imágenes también permiten la obtención de imágenes subcelulares en animales vivos que, a su vez, permiten estudiar la biología celular a nivel molecular in vivo . Los avances en la tecnología de proteínas fluorescentes y las herramientas genéticas que permiten la expresión controlada de un gen determinado en un momento específico en un tejido de interés también desempeñaron un papel importante en el desarrollo de la microscopía intravital. ^[1]

La posibilidad de generar ratones transgénicos apropiados es crucial para los estudios de microscopía intravital. Por ejemplo, para estudiar el comportamiento de las células microgliales en la enfermedad de Alzheimer, los investigadores necesitarán cruzar un ratón transgénico que sea un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer con otro ratón transgénico que sea un modelo de ratón para la visualización de células microgliales. Las células necesitan producir una proteína fluorescente para ser visualizadas y esto se puede lograr introduciendo un transgén . ^[4]

La microscopía intravital se puede realizar mediante varias técnicas de microscopía óptica, entre ellas, la fluorescencia de campo amplio, la confocal , la multifotónica , la microscopía de disco giratorio y otras. La consideración principal para la elección de una técnica en particular es la profundidad de penetración necesaria para obtener imágenes del área y la cantidad de detalles de interacción célula-célula requeridos.

Si el área de interés se encuentra a más de 50–100 μm por debajo de la superficie o existe la necesidad de capturar interacciones a pequeña escala entre células, se requiere microscopía multifotónica. La microscopía multifotónica proporciona una profundidad de penetración considerablemente mayor que la microscopía confocal de fotón único. ^[5] La microscopía multifotónica también permite visualizar células ubicadas debajo de los tejidos óseos, como las células de la médula ósea . ^[6] La profundidad máxima para la obtención de imágenes con microscopía multifotónica depende de las propiedades ópticas del tejido y del equipo experimental. Cuanto más homogéneo sea el tejido, mejor será para la microscopía intravital. Los tejidos más vascularizados son generalmente más difíciles de obtener imágenes porque los glóbulos rojos causan absorción y dispersión del haz de luz del microscopio. ^[1]

El marcado de fluorescencia de diferentes linajes celulares con proteínas de diferentes colores permite visualizar la dinámica celular en un contexto de su microambiente . Si la resolución de la imagen es lo suficientemente alta (50 – 100 μm), puede ser posible utilizar varias imágenes para generar modelos 3D de interacciones celulares, incluidas las protuberancias que las células forman al extenderse unas hacia otras. Los modelos 3D de secuencias de imágenes de lapso de tiempo permiten evaluar la velocidad y la direccionalidad de los movimientos celulares. Las estructuras vasculares también se pueden reconstruir en el espacio 3D y los cambios de su permeabilidad se pueden monitorear a lo largo de un período de tiempo a medida que la intensidad de la señal fluorescente de los tintes cambia cuando lo hace la permeabilidad vascular. La microscopía intravital de alta resolución se puede utilizar para visualizar eventos espontáneos y transitorios. ^[1]
Podría ser útil emparejar la microscopía multifotónica y confocal, ya que esto permite obtener más información de cada sesión de imágenes. Esto incluye la visualización de más tipos de células y estructuras diferentes para obtener imágenes más informativas y el uso de un solo animal para obtener imágenes de todos los diferentes tipos de células y estructuras que son de interés para un experimento determinado. ^[7] Este último es un ejemplo de la implementación del principio de las tres R.

En el pasado, la microscopía intravital sólo podía utilizarse para obtener imágenes de procesos biológicos a nivel de tejido o de células individuales. Sin embargo, gracias al desarrollo de técnicas de etiquetado subcelular y a los avances en la minimización de artefactos de movimiento (errores generados por los latidos del corazón, la respiración y los movimientos peristálticos de un animal durante la sesión de obtención de imágenes), ahora es posible obtener imágenes de la dinámica de los orgánulos intracelulares en algunos tejidos. ^[1]

Una de las principales ventajas de la microscopía intravital es la oportunidad de observar cómo las células interactúan con su microambiente . Sin embargo, la visualización de todos los tipos de células del microambiente está limitada por el número de etiquetas fluorescentes distinguibles disponibles. ^[5] También se acepta ampliamente que algunos tejidos como el cerebro se pueden visualizar más fácilmente que otros como el músculo esquelético . Estas diferencias se producen debido a la variabilidad en la homogeneidad y transparencia de los diferentes tejidos. Además, generar ratones transgénicos con un fenotipo de interés y proteínas fluorescentes en tipos de células apropiados es a menudo un desafío y requiere mucho tiempo. ^[5] Otro problema asociado con el uso de ratones transgénicos es que a veces es difícil interpretar los cambios observados entre un ratón de tipo salvaje y un ratón transgénico que representa el fenotipo de interés. La razón de esto es que los genes de función similar a menudo pueden compensar el gen alterado que conduce a cierto grado de adaptación. ^[8]

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