Inmunohistoquímica

La fijación del tejido es importante para preservarlo y mantener la morfología celular. La fórmula de fijación, la proporción de fijador a tejido y el tiempo de exposición al fijador influyen en el resultado. La solución de fijación (fijador) suele ser formalina tamponada neutra al 10 % . El tiempo de fijación habitual es de 24 horas a temperatura ambiente. La proporción de fijador a tejido varía de 1:1 a 1:20. Una vez fijado, el tejido puede incluirse en parafina. ^{[ 5 ] [ 6 ]}

Para las secciones congeladas, la fijación se suele realizar después del seccionamiento si no se van a probar nuevos anticuerpos. En ese caso, se puede utilizar acetona o formalina. ^{[ 6 ]}

El seccionamiento de la muestra de tejido se realiza con un micrótomo. Para tejido incluido en parafina, el grosor normal es de 4 μm, y para secciones congeladas, de 4 a 6 μm. ^{[ 6 ]} El grosor de las secciones cortadas es importante y constituye un factor crucial en la inmunohistoquímica. Si se compara una sección de tejido cerebral de 4 μm con una de 7 μm, es posible que falten algunos de los hallazgos en la sección de 7 μm. Esto demuestra la importancia de los métodos detallados relacionados con esta metodología. ^{[ 7 ]} Los tejidos incluidos en parafina deben desparafinarse para eliminar toda la parafina presente en la muestra y a su alrededor mediante xileno o un buen sustituto, seguido de alcohol. ^{[ 8 ]}

La recuperación de antígenos es necesaria para que los epítopos sean accesibles para la tinción inmunohistoquímica en la mayoría de las secciones de tejido fijadas con formalina. Los epítopos son los sitios de unión de los anticuerpos utilizados para visualizar el antígeno diana, que puede estar enmascarado debido a la fijación. La fijación del tejido puede causar la formación de puentes de metileno o la reticulación de grupos amino, de modo que los epítopos dejan de estar disponibles. La recuperación de antígenos puede restaurar la antigenicidad enmascarada, posiblemente mediante la ruptura de los enlaces cruzados causados ​​por la fijación. ^{[ 9 ]} La forma más común de realizar la recuperación de antígenos es mediante calentamiento a alta temperatura mientras se sumergen las láminas en una solución tampón. ^{[ 10 ]} Esto se puede hacer de diferentes maneras, por ejemplo, utilizando un horno de microondas, autoclaves, placas calefactoras o baños de agua. Para secciones congeladas, la recuperación de antígenos generalmente no es necesaria, pero para secciones congeladas que se han fijado en acetona o formalina, la recuperación de antígenos puede mejorar la señal inmunohistoquímica. ^{[ 6 ]}

La unión inespecífica de anticuerpos puede causar tinción de fondo. Aunque los anticuerpos se unen a epítopos específicos, también pueden unirse parcial o débilmente a sitios en proteínas inespecíficas que son similares al sitio de unión en la proteína diana. Al incubar el tejido con suero normal aislado de la especie en la que se produjo el anticuerpo secundario, se puede reducir la tinción de fondo. También es posible utilizar tampones de bloqueo universales disponibles comercialmente. Otros tampones de bloqueo comunes incluyen suero normal, leche desnatada en polvo, BSA o gelatina. ^{[ 5 ] [ 6 ]} La actividad enzimática endógena también puede causar tinción de fondo, pero se puede reducir si el tejido se trata con peróxido de hidrógeno. ^{[ 5 ]}

Los anticuerpos utilizados para la detección pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos policlonales se producen utilizando animales como cobayas, conejos, ratones, ratas o cabras. Al animal se le inyecta el antígeno de interés, lo que desencadena una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos se pueden aislar del suero completo del animal. La producción de anticuerpos policlonales da como resultado una mezcla de diferentes anticuerpos que reconocen múltiples epítopos. Los anticuerpos monoclonales se producen inyectando al animal el antígeno de interés y aislando posteriormente una célula B productora de anticuerpos, generalmente del bazo. Esta célula productora de anticuerpos se fusiona con una línea celular cancerosa. Esto hace que los anticuerpos muestren especificidad por un único epítopo. ^{[ 12 ]}

En las estrategias de detección inmunohistoquímica, los anticuerpos se clasifican como reactivos primarios o secundarios. Los anticuerpos primarios se generan contra un antígeno de interés y, por lo general, no están conjugados (no están marcados). Los anticuerpos secundarios se generan contra las inmunoglobulinas de la misma especie que el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario suele estar conjugado a una molécula de enlace, como la biotina, que luego recluta moléculas reporteras, o bien el propio anticuerpo secundario se une directamente a la molécula reportera. ^{[ 11 ]}

El método directo es un método de tinción de un solo paso que implica la reacción de un anticuerpo marcado directamente con el antígeno en secciones de tejido. Si bien esta técnica utiliza un solo anticuerpo y, por lo tanto, es simple y rápida, su sensibilidad es menor debido a la escasa amplificación de la señal, en contraste con los métodos indirectos. ^{[ 11 ]}

El método indirecto implica un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno diana en el tejido. Luego, se añade un anticuerpo secundario, que se une al anticuerpo primario, como una segunda capa. Como se mencionó, el anticuerpo secundario debe generarse contra el anticuerpo IgG de la especie animal en la que se generó el anticuerpo primario. Este método es más sensible que las estrategias de detección directa debido a la amplificación de la señal por la unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. ^{[ 11 ]}

El método indirecto, además de su mayor sensibilidad, también tiene la ventaja de que solo se necesita generar una cantidad relativamente pequeña de anticuerpos secundarios conjugados (marcados) estándar. Por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado, producido contra IgG de conejo, es útil con cualquier anticuerpo primario producido en conejo. Esto es particularmente útil cuando un investigador está marcando más de un anticuerpo primario, ya sea debido a la selección policlonal que produce una gama de anticuerpos primarios para un antígeno único o cuando hay interés en múltiples antígenos. Con el método directo, sería necesario marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés. ^{[ 11 ]}

Las moléculas reporteras varían según la naturaleza del método de detección, siendo las más comunes la detección cromogénica y la de fluorescencia. En la inmunohistoquímica cromogénica, un anticuerpo se conjuga con una enzima, como la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante, que puede catalizar una reacción productora de color en presencia de un sustrato cromogénico como la 3,3'-diaminobencidina (DAB). ^{[ 5 ]} El producto coloreado se puede analizar con un microscopio óptico convencional. ^{[ 13 ]} En la inmunofluorescencia, el anticuerpo se marca con un fluoróforo , como el isotiocianato de fluoresceína , el isotiocianato de tetrametilrodamina, el acetato de aminometilcumarina o la cianina 5. También se utilizan comúnmente fluorocromos sintéticos de Alexa Fluors. ^{[ 13 ] [ 14 ]} Los fluorocromos se pueden visualizar con un microscopio de fluorescencia o confocal. ^{[ 13 ]}

Para los métodos de detección cromogénica y fluorescente, el análisis densitométrico de la señal puede proporcionar datos semi- y totalmente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar el nivel de señal del reportero con el nivel de expresión o localización de la proteína. ^{[ 6 ]}

Tras la tinción inmunohistoquímica del antígeno diana, a menudo se aplica otra tinción. La contratinción proporciona un contraste que ayuda a resaltar la tinción primaria y facilita el examen de la morfología del tejido. También ayuda con la orientación y visualización de la sección de tejido. La hematoxilina es de uso común. ^{[ 6 ] [ 15 ]}

En las técnicas inmunohistoquímicas, existen varios pasos previos a la tinción final del tejido que pueden causar diversos problemas. Estos pueden incluir una tinción de fondo intensa, una tinción débil del antígeno diana y la presencia de artefactos. Es importante optimizar la calidad de los anticuerpos y las técnicas inmunohistoquímicas. ^{[ 16 ]} La biotina endógena, las enzimas reporteras o la reactividad cruzada de anticuerpos primarios/secundarios son causas comunes de una tinción de fondo intensa. ^{[ 11 ] [ 13 ]} La tinción débil o ausente puede deberse a una fijación incorrecta del tejido o a niveles bajos de antígeno. Estos aspectos de la preparación del tejido para inmunohistoquímica y la tinción con anticuerpos deben abordarse sistemáticamente para identificar y superar los problemas de tinción. ^{[ 5 ] [ 6 ]}

Los métodos para eliminar la tinción de fondo incluyen la dilución de los anticuerpos primarios o secundarios, el cambio del tiempo o la temperatura de incubación y el uso de un sistema de detección diferente o un anticuerpo primario diferente. El control de calidad debe incluir, como mínimo, un tejido que se sabe que expresa el antígeno como control positivo y controles negativos de tejido que se sabe que no expresa el antígeno, así como el tejido de prueba analizado de la misma manera omitiendo el anticuerpo primario (o mejor aún, absorbiendo el anticuerpo primario). ^{[ 5 ] [ 18 ]}

La biología tumoral permite la existencia de varios objetivos intracelulares potenciales. Muchos tumores son hormonodependientes. La presencia de receptores hormonales puede utilizarse para determinar si un tumor es potencialmente sensible a la terapia antihormonal. Una de las primeras terapias fue el antiestrógeno tamoxifeno , utilizado para tratar el cáncer de mama. Dichos receptores hormonales pueden detectarse mediante inmunohistoquímica. ^{[ 23 ]} El imatinib , un inhibidor intracelular de la tirosina quinasa , se desarrolló para tratar la leucemia mieloide crónica , una enfermedad caracterizada por la formación de una tirosina quinasa anómala específica. El imatinib ha demostrado ser eficaz en tumores que expresan otras tirosina quinasas, sobre todo KIT. La mayoría de los tumores del estroma gastrointestinal expresan KIT, que puede detectarse mediante inmunohistoquímica. ^{[ 24 ]}

Muchas proteínas que se muestran altamente reguladas al alza en estados patológicos mediante inmunohistoquímica son objetivos potenciales para terapias que utilizan anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales, debido a su tamaño, se utilizan contra objetivos de la superficie celular. Entre los objetivos sobreexpresados ​​se encuentran los miembros de la familia EGFR , proteínas transmembrana con un dominio receptor extracelular que regula una tirosina quinasa intracelular. ^{[ 25 ]} De estos, HER2/neu (también conocido como Erb-B2) fue el primero en desarrollarse. La molécula se expresa en gran medida en una variedad de tipos de células cancerosas, sobre todo en el cáncer de mama. Por ello, los anticuerpos contra HER2/neu han sido aprobados por la FDA para el tratamiento clínico del cáncer con el nombre de fármaco Herceptin . Existen pruebas inmunohistoquímicas disponibles comercialmente, Dako HercepTest, ^{[ 26 ]} Leica Biosystems Oracle ^{[ 27 ]} y Ventana Pathway. ^{[ 28 ]}

De manera similar, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (HER-1) se sobreexpresa en diversos tipos de cáncer, incluidos los de cabeza y cuello y colon. La inmunohistoquímica se utiliza para identificar a los pacientes que podrían beneficiarse de anticuerpos terapéuticos como Erbitux (cetuximab). ^{[ 29 ]} Entre los sistemas comerciales para detectar el receptor del factor de crecimiento epidérmico mediante inmunohistoquímica se encuentra el Dako pharmDx. ^{[ 30 ]}