Cromatografía de gases

La cromatografía se remonta a 1903 en el trabajo del científico ruso Mikhail Semenovich Tswett , ^{[ 5 ]} quien separó pigmentos vegetales mediante cromatografía de columna líquida.

La invención de la cromatografía de gases se atribuye a Anthony T. James y Archer JP Martin en el Instituto Nacional de Investigación Médica en Mill Hill , Londres, en 1951. ^{[ 6 ] [ 7 ]} Su cromatógrafo de gases utilizaba la cromatografía de partición como principio de separación, en lugar de la cromatografía de adsorción . La popularidad de la cromatografía de gases aumentó rápidamente tras el desarrollo del detector de ionización de llama. ^{[ 8 ]} Martin y otro de sus colegas, Richard Synge , con quien compartió el Premio Nobel de Química de 1952 , habían señalado en un artículo anterior ^{[ 9 ]} que la cromatografía también podría utilizarse para separar gases. Synge continuó su trabajo mientras Martin prosiguió su labor con James. En un intento por comercializar la tecnología poco después de su invención, Griffin and George Ltd., con sede en Londres, fabricó y vendió cromatógrafos de gases en 1954. ^{[ 10 ]} Otras compañías, como Pye Unicam, con sede en Cambridge, y compañías con sede en los EE. UU., seguirían el ejemplo en 1955 y 1956. ^{[ 10 ]}

La química física alemana Erika Cremer, en 1947, junto con el estudiante de posgrado austriaco Fritz Prior, desarrolló lo que podría considerarse el primer cromatógrafo de gases, que consistía en un gas portador, una columna rellena de gel de sílice y un detector de conductividad térmica. Exhibieron el cromatógrafo en ACHEMA en Frankfurt, pero no despertó interés. ^{[ 11 ]} NC Turner, de la Burrell Corporation, presentó en 1943 un instrumento de gran tamaño que utilizaba una columna de carbón y vapores de mercurio. Stig Claesson, de la Universidad de Uppsala, publicó en 1946 su trabajo sobre una columna de carbón que también utilizaba mercurio. ^{[ 11 ]} Gerhard Hesse, siendo profesor en la Universidad de Marburgo /Lahn, decidió poner a prueba la opinión predominante entre los químicos alemanes de que las moléculas no podían separarse en una corriente de gas en movimiento. Montó una sencilla columna de vidrio rellena de almidón y separó con éxito el bromo y el yodo utilizando nitrógeno como gas portador. Luego construyó un sistema que hacía fluir un gas inerte a través de un condensador de vidrio relleno de gel de sílice y recolectaba las fracciones eluidas. ^{[ 11 ]} Courtenay SG Phillips de la Universidad de Oxford investigó la separación en una columna de carbón utilizando un detector de conductividad térmica. Consultó con Claesson y decidió utilizar el desplazamiento como principio de separación. Después de conocer los resultados de James y Martin, cambió a la cromatografía de partición. ^{[ 11 ]}

La cromatografía de gases inicial utilizaba columnas empaquetadas, formadas por bloques de 1 a 5 m de longitud y de 1 a 5  mm de diámetro, rellenos de partículas. La resolución de las columnas empaquetadas mejoró con la invención de la columna capilar, en la que la fase estacionaria se deposita en la pared interna del capilar. ^{[ 6 ]}

El muestreador automático permite introducir la muestra automáticamente en las entradas. Si bien es posible la inserción manual, ya no es común. La inserción automática ofrece mayor reproducibilidad y optimiza el tiempo.

Existen diferentes tipos de automuestreadores. Los automuestreadores se pueden clasificar en relación con la capacidad de muestra (autoinyectores frente a automuestreadores, donde los autoinyectores pueden procesar un número reducido de muestras), con las tecnologías robóticas (robot XYZ ^{[ 12 ]} frente a robot rotatorio, el más común) o con el análisis:

• Líquido
• Espacio de cabeza estático mediante tecnología de jeringa
• Espacio libre dinámico mediante tecnología de línea de transferencia
• microextracción en fase sólida (SPME)

La entrada de la columna (o inyector) permite introducir una muestra en un flujo continuo de gas portador. La entrada es un componente que se acopla al cabezal de la columna.

Los tipos de entrada más comunes son:

• Inyector S/SL (con o sin división): la muestra se introduce en una pequeña cámara calentada mediante una jeringa a través de un septo. El calor facilita la volatilización de la muestra y su matriz. El gas portador arrastra entonces la muestra completa (modo sin división) o una porción (modo con división) hacia la columna. En el modo con división, una parte de la mezcla de muestra/gas portador en la cámara de inyección se expulsa a través de la válvula de división. La inyección con división es preferible cuando se trabaja con muestras con altas concentraciones de analito (>0,1 %), mientras que la inyección sin división es más adecuada para el análisis de trazas con bajas cantidades de analito (<0,01 %). En el modo sin división, la válvula de división se abre después de un tiempo preestablecido para purgar los elementos más pesados ​​que, de otro modo, contaminarían el sistema. Este tiempo preestablecido (sin división) debe optimizarse: un tiempo más corto (p. ej., 0,2 min) garantiza una menor cola, pero una pérdida de respuesta; un tiempo más largo (2 min) aumenta la cola, pero también la señal. ^{[ 13 ]}
• Entrada en columna: la muestra se introduce directamente en la columna en su totalidad, sin calentarla o a una temperatura inferior al punto de ebullición del disolvente. La baja temperatura condensa la muestra en una zona estrecha. Posteriormente, se calientan la columna y la entrada, liberando la muestra a la fase gaseosa. Esto garantiza la temperatura más baja posible para la cromatografía y evita que las muestras se descompongan por encima de su punto de ebullición.
• El inyector PTV (inyector de temperatura programada) fue descrito por primera vez por Vogt en 1979. Originalmente, Vogt desarrolló la técnica como un método para la introducción de grandes volúmenes de muestra (hasta 250 μL) en cromatografía de gases capilar. Vogt introdujo la muestra en el revestimiento a una velocidad de inyección controlada. La temperatura del revestimiento se seleccionó ligeramente por debajo del punto de ebullición del disolvente. El disolvente de bajo punto de ebullición se evaporaba continuamente y se expulsaba a través de la línea de división. Basándose en esta técnica, Poy desarrolló el inyector de vaporización de temperatura programada (PTV). Al introducir la muestra a una baja temperatura inicial del revestimiento, se pudieron evitar muchas de las desventajas de las técnicas clásicas de inyección en caliente.
• Entrada de la fuente de gas o válvula de conmutación de gas: las muestras gaseosas en frascos de recolección se conectan a lo que generalmente es una válvula de conmutación de seis puertos. El flujo del gas portador no se interrumpe mientras se expande una muestra en un bucle de muestra previamente evacuado. Al conmutar, el contenido del bucle de muestra se introduce en la corriente de gas portador.
• Sistema P/T (purga y trampa): Se burbujea un gas inerte a través de una muestra acuosa, lo que provoca la purga de los compuestos volátiles insolubles de la matriz. Estos volátiles quedan atrapados en una columna absorbente (conocida como trampa o concentrador) a temperatura ambiente. Posteriormente, la trampa se calienta y los volátiles se dirigen a la corriente de gas portador. Las muestras que requieren preconcentración o purificación pueden introducirse mediante este sistema, que generalmente se conecta al puerto S/SL.

La elección del gas portador (fase móvil) es importante. El hidrógeno ofrece un rango de caudales con una eficiencia comparable a la del helio. Sin embargo, el helio puede ser más eficiente y proporcionar la mejor separación si se optimizan los caudales. El helio no es inflamable y funciona con una mayor variedad de detectores e instrumentos más antiguos. Por lo tanto, es el gas portador más utilizado. No obstante, su precio ha aumentado considerablemente en los últimos años, lo que ha llevado a un número creciente de cromatógrafos a optar por el hidrógeno. Es posible que el uso histórico, más que una consideración racional, contribuya a la persistencia del uso preferencial del helio.

Los detectores más utilizados son el detector de ionización de llama (FID) y el detector de conductividad térmica (TCD). Si bien los TCD son beneficiosos por ser no destructivos, su bajo límite de detección para la mayoría de los analitos limita su uso generalizado. ^{[ 1 ]} Los FID son sensibles principalmente a los hidrocarburos, y son más sensibles a ellos que los TCD. ^{[ 4 ]} Los FID no pueden detectar agua ni dióxido de carbono, lo que los hace ideales para el análisis de analitos orgánicos ambientales. ^{[ 1 ]} El FID es de dos a tres veces más sensible a la detección de analitos que el TCD. ^{[ 1 ]}

El TCD se basa en la conductividad térmica de la materia que pasa alrededor de un hilo delgado de tungsteno-renio por el que circula una corriente. ^{[ 4 ]} En esta configuración, el helio o el nitrógeno sirven como gas portador debido a su conductividad térmica relativamente alta, que mantiene el filamento frío y conserva una resistividad y eficiencia eléctrica uniformes. ^{[ 4 ] [ 14 ]} Cuando las moléculas del analito eluyen de la columna, mezcladas con el gas portador, la conductividad térmica disminuye mientras que aumenta la temperatura y la resistividad del filamento, lo que provoca fluctuaciones de voltaje que, en última instancia, generan una respuesta del detector. ^{[ 4 ] [ 14 ]} La sensibilidad del detector es proporcional a la corriente del filamento e inversamente proporcional a la temperatura ambiente inmediata del detector, así como al caudal del gas portador. ^{[ 4 ]}

En un detector de ionización de llama (FID), los electrodos se colocan junto a una llama alimentada con hidrógeno/aire cerca de la salida de la columna, y cuando los compuestos que contienen carbono salen de la columna, se pirolizan por la llama. ^{[ 4 ] [ 14 ]} Este detector funciona solo para compuestos orgánicos/hidrocarburos debido a la capacidad de los carbonos para formar cationes y electrones durante la pirólisis, lo que genera una corriente entre los electrodos. ^{[ 4 ] [ 14 ]} El aumento de la corriente se traduce y aparece como un pico en un cromatograma. Los FID tienen límites de detección bajos (unos pocos picogramos por segundo), pero no pueden generar iones a partir de carbonos que contienen carbonilo . ^{[ 4 ]} Los gases portadores compatibles con FID incluyen helio, hidrógeno, nitrógeno y argón. ^{[ 4 ] [ 14 ]}

En la detección por ionización de llama (FID), a veces la corriente se modifica antes de entrar en el detector. Un metanizador convierte el monóxido de carbono y el dióxido de carbono en metano para que pueda detectarse. Otra tecnología, el poliarco de Activated Research Inc., convierte todos los compuestos en metano.

El detector de llama alcalina (AFD) o detector de ionización de llama alcalina (AFID) tiene una alta sensibilidad al nitrógeno y al fósforo, similar a la del NPD. Sin embargo, los iones de metales alcalinos se suministran con el gas hidrógeno, en lugar de una perla sobre la llama. Por esta razón, el AFD no sufre la "fatiga" del NPD, sino que proporciona una sensibilidad constante durante un período prolongado. Además, cuando no se añaden iones alcalinos a la llama, el AFD funciona como un FID estándar. Un detector de combustión catalítica (CCD) mide hidrocarburos combustibles e hidrógeno. El detector de ionización por descarga (DID) utiliza una descarga eléctrica de alto voltaje para producir iones.

El detector fotométrico de llama (FPD) utiliza un tubo fotomultiplicador para detectar las líneas espectrales de los compuestos mientras se queman en una llama. Los compuestos que eluyen de la columna son llevados a una llama alimentada con hidrógeno que excita elementos específicos en las moléculas, y los elementos excitados (P, S, halógenos, algunos metales) emiten luz de longitudes de onda características específicas. ^{[ 14 ]} La luz emitida es filtrada y detectada por un tubo fotomultiplicador. ^{[ 4 ] [ 14 ]} En particular, la emisión de fósforo está alrededor de 510–536  nm y la emisión de azufre está en 394  nm. ^{[ 4 ] [ 14 ]} Con un detector de emisión atómica (AED), una muestra que eluye de una columna entra en una cámara que es energizada por microondas que inducen un plasma. ^{[ 14 ]} El plasma hace que la muestra de analito se descomponga y ciertos elementos generan un espectro de emisión atómica. ^{[ 14 ]} El espectro de emisión atómica es difractado por una rejilla de difracción y detectado por una serie de tubos fotomultiplicadores o fotodiodos. ^{[ 14 ]}

El detector de captura de electrones (ECD) utiliza una fuente de partículas beta radiactivas (electrones) para medir el grado de captura de electrones. Los ECD se utilizan para la detección de moléculas que contienen elementos electronegativos/atractores y grupos funcionales como halógenos, carbonilos, nitrilos, grupos nitro y organometálicos. ^{[ 4 ] [ 14 ]} En este tipo de detector se utiliza nitrógeno o metano al 5% en argón como gas portador de la fase móvil. ^{[ 4 ] [ 14 ]} El gas portador pasa entre dos electrodos colocados al final de la columna, y adyacente al cátodo (electrodo negativo) se encuentra una lámina radiactiva como 63Ni. ^{[ 4 ] [ 14 ]} La lámina radiactiva emite una partícula beta (electrón) que colisiona con el gas portador y lo ioniza para generar más iones, lo que resulta en una corriente. ^{[ 4 ] [ 14 ]} Cuando las moléculas del analito con elementos o grupos funcionales electronegativos/atractores capturan electrones, esto resulta en una disminución de la corriente que genera una respuesta del detector. ^{[ 4 ] [ 14 ]}

El detector de nitrógeno-fósforo (NPD, por sus siglas en inglés) es un tipo de detector termoiónico en el que el nitrógeno y el fósforo alteran la función de trabajo de una microesfera recubierta especialmente, y se mide la corriente resultante.

El detector de conductividad electrolítica en seco (DELCD) utiliza una fase gaseosa y alta temperatura (V. Coulsen) para medir compuestos clorados.

El espectrómetro de masas (EM), también llamado GC-EM , es altamente eficaz y sensible, incluso con pequeñas cantidades de muestra. Este detector permite identificar los analitos en los cromatogramas mediante su espectro de masas. ^{[ 15 ]} Algunos GC-EM están conectados a un espectrómetro de RMN que actúa como detector de respaldo. Esta combinación se conoce como GC-EM-RMN . Otros GC-EM-RMN están conectados a un espectrofotómetro infrarrojo que también actúa como detector de respaldo. Esta combinación se conoce como GC-EM-RMN-IR. Sin embargo, cabe destacar que esto es muy poco frecuente, ya que la mayoría de los análisis necesarios pueden realizarse únicamente mediante GC-EM.

La radiación ultravioleta de vacío (VUV) representa el desarrollo más reciente en detectores de cromatografía de gases. La mayoría de las especies químicas absorben y presentan secciones transversales de absorción únicas en fase gaseosa en el  rango de longitud de onda VUV monitorizado, de aproximadamente 120 a 240 nm. Cuando se conocen las secciones transversales de absorción de los analitos, el detector VUV permite la determinación absoluta (sin calibración) del número de moléculas presentes en la celda de flujo en ausencia de interferencias químicas. ^{[ 16 ]}

El detector olfatométrico , también llamado GC-O, utiliza un evaluador humano para analizar la actividad olfativa de los compuestos. Mediante un puerto de olor o un puerto de olfacción, se puede evaluar la calidad, la intensidad y la duración del olor de un compuesto.

Otros detectores incluyen el detector de conductividad electrolítica de Hall (ElCD), el detector de ionización de helio (HID), el detector de infrarrojos (IRD), el detector de fotoionización (PID), el detector de ionización por descarga pulsada (PDD) y el detector de ionización termoiónica (TID). ^{[ 17 ]}

Los gases portadores típicos incluyen helio , nitrógeno , argón e hidrógeno . ^{[ 4 ] [ 1 ]} El gas a utilizar generalmente viene determinado por el detector que se esté utilizando; por ejemplo, un DID requiere helio como gas portador. ^{[ 1 ]} Al analizar muestras de gas, el portador también se selecciona en función de la matriz de la muestra; por ejemplo, al analizar una mezcla en argón, se prefiere un portador de argón porque el argón en la muestra no aparece en el cromatograma. La seguridad y la disponibilidad también pueden influir en la selección del portador.

La pureza del gas portador también suele estar determinada por el detector, aunque el nivel de sensibilidad requerido también puede influir significativamente. Normalmente, se utilizan purezas del 99,995 % o superiores. Los grados de pureza más comunes que requieren los instrumentos modernos para la mayoría de las sensibilidades son de grado 5.0, o 99,999 %, lo que significa que hay un total de 10 ppm de impurezas en el gas portador que podrían afectar los resultados. Los grados de pureza más altos de uso común son de grado 6.0, pero la necesidad de detección a niveles muy bajos en algunas aplicaciones forenses y ambientales ha impulsado la demanda de gases portadores con una pureza de grado 7.0, que ahora están disponibles comercialmente. Los nombres comerciales para las purezas típicas incluyen "Grado Cero", "Grado de Ultra Alta Pureza (UHP)", "Grado 4.5" y "Grado 5.0".

La velocidad lineal del gas portador afecta al análisis de la misma manera que la temperatura (véase más arriba). A mayor velocidad lineal, más rápido es el análisis, pero menor es la separación entre los analitos. Por lo tanto, seleccionar la velocidad lineal implica el mismo compromiso entre el nivel de separación y la duración del análisis que seleccionar la temperatura de la columna. La velocidad lineal se implementará mediante el caudal del gas portador, en función del diámetro interno de la columna.

En los cromatógrafos de gases fabricados antes de la década de 1990, el caudal del gas portador se controlaba indirectamente regulando la presión de entrada del mismo, o "presión en la cabeza de la columna". El caudal real se medía a la salida de la columna o del detector con un caudalímetro electrónico o un medidor de flujo de burbujas, lo que podía resultar un proceso complejo, laborioso y frustrante. No era posible variar la presión durante la corrida, por lo que el caudal permanecía prácticamente constante durante el análisis. La relación entre el caudal y la presión de entrada se calcula mediante la ecuación de Poiseuille para fluidos compresibles .

Sin embargo, muchos cromatógrafos de gases modernos miden electrónicamente el caudal y controlan electrónicamente la presión del gas portador para ajustar dicho caudal. En consecuencia, las presiones y los caudales del gas portador pueden ajustarse durante el análisis, creando programas de presión/caudal similares a los programas de temperatura.

La polaridad del soluto es crucial para la elección del compuesto estacionario, que en condiciones óptimas tendría una polaridad similar a la del soluto. Las fases estacionarias comunes en columnas tubulares abiertas son el cianopropilfenil dimetil polisiloxano, el polietilenglicol Carbowax, el biscianopropil cianopropilfenil polisiloxano y el difenil dimetil polisiloxano. Para columnas empaquetadas, existen más opciones. ^{[ 4 ]}

La elección del tipo de entrada y la técnica de inyección depende de si la muestra está en estado líquido, gaseoso, adsorbido o sólido, y de si hay una matriz de disolvente presente que deba vaporizarse. Las muestras disueltas pueden introducirse directamente en la columna mediante un inyector COC, si las condiciones son bien conocidas; si hay que vaporizar y eliminar parcialmente una matriz de disolvente, se utiliza un inyector S/SL (la técnica de inyección más común); las muestras gaseosas (por ejemplo, cilindros de aire) se inyectan normalmente mediante un sistema de válvula de conmutación de gas; las muestras adsorbidas (por ejemplo, en tubos adsorbentes) se introducen mediante un aparato de desorción externo (en línea o fuera de línea), como un sistema de purga y trampa, o se desorben en el inyector (aplicaciones SPME).

La elección de la columna depende de la muestra y del principio activo que se va a medir. El principal atributo químico a considerar al elegir una columna es la polaridad de la mezcla, pero los grupos funcionales también influyen considerablemente. La polaridad de la muestra debe coincidir estrechamente con la de la fase estacionaria de la columna para mejorar la resolución y la separación, a la vez que se reduce el tiempo de análisis. La separación y el tiempo de análisis también dependen del espesor de la película (de la fase estacionaria), del diámetro de la columna y de su longitud.

En un cromatógrafo de gases (GC), la(s) columna(s) se encuentran dentro de un horno cuya temperatura se controla electrónicamente con precisión. (Cuando un analista habla de la "temperatura de la columna", se refiere técnicamente a la temperatura del horno de la columna. Sin embargo, esta distinción no es relevante y no se abordará en este artículo).

La velocidad a la que una muestra atraviesa la columna es directamente proporcional a su temperatura. Cuanto mayor sea la temperatura de la columna, más rápido se desplazará la muestra. Sin embargo, cuanto más rápido se desplace la muestra, menor será su interacción con la fase estacionaria y menor la separación de los analitos.

En general, la temperatura de la columna se selecciona buscando un equilibrio entre la duración del análisis y el grado de separación.

El método que mantiene la columna a la misma temperatura durante todo el análisis se denomina "isotérmico". Sin embargo, la mayoría de los métodos aumentan la temperatura de la columna durante el análisis; la temperatura inicial, la velocidad de aumento de la temperatura (la "rampa" de temperatura) y la temperatura final se denominan programa de temperatura.

Un programa de temperatura permite que los analitos que eluyen al principio del análisis se separen adecuadamente, al tiempo que reduce el tiempo que tardan los analitos que eluyen más tarde en pasar a través de la columna.

Generalmente, los datos cromatográficos se presentan como una gráfica de la respuesta del detector (eje y) frente al tiempo de retención (eje x), denominada cromatograma. Esta gráfica muestra un espectro de picos que representan los analitos presentes en la muestra, los cuales eluyen de la columna en diferentes momentos. El tiempo de retención puede utilizarse para identificar analitos si las condiciones del método son constantes. Asimismo, el patrón de picos se mantiene constante para una muestra en condiciones constantes, lo que permite identificar mezclas complejas de analitos. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones modernas, el cromatógrafo de gases (GC) se conecta a un espectrómetro de masas o detector similar capaz de identificar los analitos representados por los picos.

El área bajo un pico es proporcional a la cantidad de analito presente en el cromatograma. Al calcular el área del pico mediante la función matemática de integración , se puede determinar la concentración de un analito en la muestra original. La concentración se puede calcular utilizando una curva de calibración creada al hallar la respuesta para una serie de concentraciones de analito, o bien determinando el factor de respuesta relativo de un analito. El factor de respuesta relativo es la relación esperada de un analito con respecto a un estándar interno (o externo ) y se calcula hallando la respuesta de una cantidad conocida de analito y una cantidad constante de estándar interno (una sustancia química añadida a la muestra a una concentración constante, con un tiempo de retención distinto al del analito).

En la mayoría de los sistemas GC-MS modernos , se utiliza software informático para dibujar e integrar los picos y comparar los espectros de masas con los espectros de la biblioteca.