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Análisis forense de ADN

doble hélice de ADN El análisis forense de ADN consiste en la determinación de un perfil genético con fines legales y de investigación. Los métodos de análisis de ADN han evoluc...

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doble hélice de ADN

El análisis forense de ADN consiste en la determinación de un perfil genético con fines legales y de investigación. Los métodos de análisis de ADN han evolucionado innumerables veces a lo largo de los años gracias a los avances tecnológicos, que permiten obtener más información con menos material de partida. El análisis de ADN moderno se basa en el cálculo estadístico de la rareza del perfil genético obtenido dentro de una población.

Si bien es más conocida como herramienta en investigaciones forenses, la elaboración de perfiles de ADN también puede utilizarse con fines no forenses, como pruebas de paternidad e investigación genealógica humana .

Historia

Jeffrey Glassberg fue el primero en patentar una metodología para la identificación humana y las pruebas de paternidad a partir del análisis de ADN. [ 1 ]

Los métodos para producir un perfil de ADN fueron desarrollados por Alec Jeffreys y su equipo en 1985. Jeffreys descubrió que una muestra desconocida de ADN, como sangre, cabello, saliva o semen, podía analizarse y generarse un patrón/perfil de ADN único. [ 2 ] Un año después de su descubrimiento, se le pidió a Jeffreys que utilizara su nuevo método de análisis de ADN para condenar a un hombre que la policía creía responsable de dos violaciones y asesinatos. Jeffreys demostró la inocencia del hombre utilizando el ADN de la escena del crimen. [ 3 ]

Cuando se descubrió el análisis de ADN, se utilizó un proceso llamado Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) para analizar el ADN. Sin embargo, el RFLP era un proceso ineficiente debido a que consumía grandes cantidades de ADN que no siempre se podían obtener de la escena de un crimen. La tecnología actual ha evolucionado más allá del RFLP. El análisis de Repeticiones Cortas en Tándem (STR) es el equivalente moderno del RFLP. El análisis STR no solo utiliza una menor cantidad de muestra para analizar el ADN, sino que también forma parte de un proceso más amplio llamado Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La PCR es un proceso que se puede utilizar para reproducir rápidamente hasta mil millones de copias de un segmento único de ADN. [ 4 ]

Costos

Las investigaciones genealógicas forenses de ADN son muy costosas, ya que requieren analizar a un gran número de personas y construir extensos árboles genealógicos. [ 5 ] El acceso a bases de datos de consumidores que realizaron pruebas de ADN por diversión tampoco es barato. [ 5 ] La policía holandesa realizó análisis masivos de ADN en algunos casos. [ 6 ]

Métodos

Métodos retirados

Análisis RFLP

Seis individuos con diferente número de repeticiones en una misma ubicación de su genoma, mostrados en un gel.

El primer método verdadero de perfilado de ADN fue el análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). El primer uso del análisis RFLP en casos forenses se dio en 1985 en el Reino Unido. [ 7 ] Este tipo de análisis utilizó repeticiones en tándem de número variable (VNTR) para distinguir entre individuos. Las VNTR son comunes en todo el genoma y consisten en la misma secuencia de ADN repetida una y otra vez. [ 8 ] Diferentes individuos pueden tener un número diferente de repeticiones en una ubicación específica del genoma. [ 7 ] Por ejemplo, la persona A podría tener 4 repeticiones, mientras que la persona B podría tener 5. Las diferencias se visualizaban mediante un proceso llamado electroforesis en gel . Los fragmentos más pequeños se desplazaban más lejos a través del gel que los fragmentos más grandes, separándolos. [ 9 ] Estas diferencias se utilizaron para distinguir entre individuos y, cuando se analizaron múltiples sitios VNTR simultáneamente, el análisis RFLP tiene un alto grado de poder de individualización. [ 10 ]

El proceso de análisis RFLP era extremadamente laborioso y, debido a la longitud de las repeticiones utilizadas, entre 9 y 100 pares de bases, [ 8 ] [ 11 ] no se podían utilizar métodos de amplificación como la reacción en cadena de la polimerasa . Esto limitaba el RFLP a muestras que ya contaban con una mayor cantidad de ADN disponible inicialmente y no funcionaba bien con muestras degradadas. [ 12 ] El análisis RFLP fue el principal tipo de análisis realizado en la mayoría de los laboratorios forenses antes de ser finalmente retirado y reemplazado por métodos más nuevos. Fue abandonado por completo por el FBI en 2000 y reemplazado por el análisis STR. [ 13 ]

Pruebas alfa de DQ

Una tira reactiva de prueba DQ alfa que muestra un resultado positivo. Los puntos rellenos representan los valores alélicos para esa muestra.

Desarrollada en 1991, [ 13 ] la prueba DQ alfa fue la primera técnica forense de ADN que utilizó la reacción en cadena de la polimerasa. [ 14 ] Esta técnica permitió el uso de muchas menos células que el análisis RFLP, lo que la hizo más útil para escenas del crimen que no tenían las grandes cantidades de material de ADN que se requerían anteriormente. [ 15 ] El locus (o ubicación) DQ alfa 1 también era polimórfico y tenía múltiples alelos diferentes que podían usarse para limitar el grupo de individuos que podrían haber producido ese resultado y aumentar la probabilidad de exclusión. [ 16 ]

El locus alfa DQ se combinó con otros loci en un kit comercial llamado Polymarker en 1993. [ 17 ] Polymarker fue un precursor de los modernos kits de multiplexación y permitió examinar múltiples loci diferentes con un solo producto. Si bien era más sensible que el análisis RFLP, Polymarker no tenía el mismo poder discriminatorio que las pruebas RFLP anteriores. [ 17 ] Para 1995, los científicos intentaron volver a un análisis basado en VNTR combinado con tecnología PCR llamado polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AmpFLP). [ 13 ]

AmpFLP

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa que muestra el locus D1S80 en múltiples carriles utilizando AmpFLP.

AmpFLP fue el primer intento de combinar el análisis VNTR con la PCR para casos forenses. Este método utilizaba VNTR más cortos que el análisis RFLP, entre 8 y 16 pares de bases. El menor tamaño de pares de bases de AmpFLP se diseñó para funcionar mejor con el proceso de amplificación de la PCR. [ 11 ] Se esperaba que esta técnica permitiera el poder discriminatorio del análisis RFLP con la capacidad de procesar muestras con menos ADN molde o que estuvieran degradadas. Sin embargo, solo se validaron unos pocos loci para aplicaciones forenses compatibles con el análisis AmpFLP, ya que los laboratorios forenses rápidamente adoptaron otras técnicas que limitaron su capacidad discriminatoria para muestras forenses. [ 18 ]

La técnica finalmente nunca se utilizó ampliamente, aunque todavía se usa en países más pequeños debido a su menor costo y configuración más simple en comparación con métodos más nuevos. [ 19 ] [ 20 ] A finales de la década de 1990, los laboratorios comenzaron a cambiar a métodos más nuevos, incluido el análisis STR. Estos usaban fragmentos de ADN aún más cortos y podían amplificarse de manera más confiable usando PCR, manteniendo e incluso mejorando el poder discriminatorio de los métodos anteriores. [ 13 ]

Métodos actuales

Análisis STR

Un electroferograma parcial producido mediante análisis STR.

El análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) es el principal tipo de análisis forense de ADN que se realiza en los laboratorios de ADN modernos. El análisis STR se basa en RFLP y AmpFLP, utilizados anteriormente, al reducir el tamaño de las unidades de repetición a entre 2 y 6 pares de bases y al combinar múltiples loci diferentes en una sola reacción de PCR. Estos kits de ensayo multiplexados pueden generar valores alélicos para docenas de loci diferentes en todo el genoma simultáneamente, lo que reduce el tiempo necesario para obtener un perfil completo e individualizado. El análisis STR se ha convertido en el método de referencia para la elaboración de perfiles de ADN y se utiliza ampliamente en aplicaciones forenses.

El análisis STR también puede limitarse al cromosoma Y. Este análisis se puede utilizar en casos de paternidad o en la búsqueda de familiares, ya que el cromosoma Y es idéntico por línea paterna (excepto en casos de mutación ). Algunos kits de multiplexación combinan loci autosómicos y Y-STR en un solo kit, lo que reduce aún más el tiempo necesario para obtener una gran cantidad de datos.

Actualmente, el análisis STR requiere múltiples células para crear un perfil de ADN completo. Sin embargo, la ciencia se está acercando a la creación de un perfil de ADN completo utilizando el análisis STR en células individuales. [ 21 ]

secuenciación del ADN mitocondrial

La secuenciación del ADN mitocondrial es una técnica especializada que utiliza el ADN mitocondrial presente en la mayoría de las células. Este ADN se transmite por vía materna y no es único entre individuos. Sin embargo, debido a la cantidad de mitocondrias presentes en las células, el análisis del ADNmt puede utilizarse en muestras muy degradadas o en muestras donde el análisis STR no proporcionaría datos suficientes para ser útil. El ADNmt también está presente en lugares donde el ADN autosómico estaría ausente, como en el tallo del cabello.

Debido al mayor riesgo de contaminación al manipular ADN mitocondrial, pocos laboratorios procesan muestras mitocondriales. Aquellos que lo hacen cuentan con protocolos especializados que separan aún más las diferentes muestras entre sí para evitar la contaminación cruzada.

ADN rápido

La tecnología Rapid DNA permite obtener un perfil de ADN a partir de una muestra de hisopo, automatizando por completo el proceso de extracción, amplificación y análisis del ADN. Los instrumentos Rapid DNA pueden generar un perfil de ADN a partir de una muestra de hisopo en tan solo 90 minutos, eliminando la necesidad de personal científico especializado. Se está considerando su uso en el proceso de registro de delincuentes, permitiendo a los agentes de policía obtener el perfil de ADN de la persona detenida.

Recientemente, se aprobó en Estados Unidos la Ley de ADN Rápido de 2017 , que ordena al FBI crear protocolos para la implementación de esta tecnología en todo el país. Actualmente, el ADN obtenido con estos instrumentos no puede cargarse en bases de datos nacionales de ADN, ya que no analizan suficientes loci para cumplir con el umbral estándar. Sin embargo, varias agencias policiales ya utilizan instrumentos de ADN rápido para recolectar muestras de personas arrestadas en su área. Estas bases de datos locales de ADN no están sujetas a regulaciones federales ni estatales.

Secuenciación masivamente paralela

También conocida como secuenciación de nueva generación, la secuenciación masivamente paralela (MPS) se basa en el análisis STR al introducir la secuenciación directa de los loci. En lugar del número de repeticiones presentes en cada ubicación, la MPS proporciona al científico la secuencia real de pares de bases. Teóricamente, la MPS tiene la capacidad de distinguir entre gemelos idénticos, ya que se observarían mutaciones puntuales aleatorias dentro de los segmentos de repetición que no serían detectadas por el análisis STR tradicional.

Rareza del perfil

Cuando se utiliza un perfil de ADN como prueba, se proporciona una estadística de coincidencia que explica la rareza de dicho perfil dentro de una población. Específicamente, esta estadística representa la probabilidad de que una persona elegida al azar de una población tenga ese perfil de ADN específico. No se trata de la probabilidad de que el perfil "coincida" con el de alguien . Existen diversos métodos para determinar esta estadística, y cada uno es utilizado por distintos laboratorios según su experiencia y preferencias. Sin embargo, el cálculo de la razón de verosimilitud se está convirtiendo en el método preferido frente a los otros dos métodos más comunes: la exclusión de individuos elegidos al azar y la probabilidad combinada de inclusión. Las estadísticas de coincidencia son especialmente importantes en la interpretación de mezclas, donde existe más de un contribuyente a un perfil de ADN. Cuando estas estadísticas se presentan en un tribunal o en un informe de laboratorio, generalmente se proporcionan para las tres razas más comunes de esa área específica. Esto se debe a que las frecuencias alélicas en diferentes loci varían según la ascendencia del individuo. https://strbase.nist.gov/training/6_Mixture-Statistics.pdf Archivado el 15 de agosto de 2022 en Wayback Machine

Hombre cualquiera no excluido

La probabilidad obtenida con este método es la probabilidad de que una persona seleccionada al azar de la población no pueda ser excluida de los datos analizados. Este tipo de estadística de coincidencia es fácil de explicar en un tribunal a personas sin formación científica, pero también pierde gran parte de su capacidad discriminatoria, ya que no tiene en cuenta el genotipo del sospechoso. Este enfoque se utiliza comúnmente cuando la muestra está degradada o contiene tantos contribuyentes que no se puede determinar un perfil único. También resulta útil para explicar a personas no expertas, ya que el método para obtener la estadística es sencillo. Sin embargo, debido a su limitada capacidad discriminatoria, el RMNE no se suele realizar a menos que no se pueda utilizar ningún otro método. No se recomienda el uso de RMNE en datos que indiquen la presencia de una mezcla.

Probabilidad combinada de inclusión/exclusión

Un único perfil de fuente que muestra dos alelos en el locus vWA.
Una mezcla de tres personas que muestra cuatro alelos en el locus vWA.

La probabilidad combinada de inclusión o exclusión calcula la probabilidad de que una persona aleatoria, no emparentada, contribuya a un perfil de ADN o a una mezcla de ADN. En este método, las estadísticas de cada locus individual se determinan utilizando estadísticas poblacionales y luego se combinan para obtener el CPI o CPE total. Estos cálculos se repiten para todos los loci disponibles con todos los datos disponibles y luego cada valor se multiplica para obtener la probabilidad combinada total de inclusión o exclusión. Dado que los valores se multiplican entre sí, se pueden obtener números extremadamente pequeños utilizando el CPI. El CPI o CPE se considera un cálculo estadístico aceptable cuando se indica una mezcla. https://www.promega.com/-/media/files/resources/conference-proceedings/ishi-15/parentage-and-mixture-statistics-workshop/generalpopulationstats.pdf?la=en

Ejemplo de cálculo para un perfil de fuente única

Probabilidad de que un caucásico tenga el alelo 14 en vWA = 0,10204

Probabilidad de que un caucásico tenga el alelo 17 en vWA = 0,26276

Probabilidad de que un caucásico tenga un alelo 14 o un alelo 17 (P) = 0,10204 + 0,26276 = 0,3648

Probabilidad de que estén presentes otros alelos (Q) = 1 - P o 1 - 0,3648 = 0,6352

Probabilidad de exclusión para vWA = Q 2 + 2Q(1-Q) o 0,6352 2 + 2(0,6352)(1 - 0,6352) = 0,86692096 ≈ 86,69%

Probabilidad de inclusión para vWA = 1 - CPE o 1 - 0,86692096 = 0,13307904 ≈ 13,31%

Ejemplo de cálculo para el perfil de mezcla

Probabilidad de que un caucásico tenga el alelo 14 en vWA = 0,10204

Probabilidad de que un caucásico tenga el alelo 15 en vWA = 0,11224

Probabilidad de que un caucásico tenga el alelo 16 en vWA = 0,20153

Probabilidad de que un caucásico tenga el alelo 19 en vWA = 0,08418

Probabilidad de que un caucásico tenga cualquiera de los 14, 15, 16 o 19 alelos (P) = 0,10204 + 0,11224 + 0,20153 + 0,08418 = 0,49999

Probabilidad de que estén presentes otros alelos (Q) = 1 - P o 1 - 0,49999 = 0,50001

Probabilidad de exclusión para vWA = Q 2 + 2Q(1-Q) o 0,50001 2 + 2(0,50001)(1 - 0,50001) = 0,7500099999 ≈ 75%

Probabilidad de inclusión para vWA = 1 - CPE o 1 - 0,7500099999 = 0,2499900001 ≈ 25%

razón de verosimilitud

Las razones de verosimilitud (RV) comparan dos probabilidades diferentes para determinar cuál es más probable. En un juicio, la RV es la probabilidad del argumento de la fiscalía frente a la probabilidad del argumento de la defensa, dadas sus suposiciones iniciales. En este caso, la probabilidad de la fiscalía suele ser igual a 1, ya que se asume que la fiscalía no procesaría a un sospechoso a menos que tuviera la certeza absoluta (100%) de que se trata de la persona correcta. Las razones de verosimilitud son cada vez más comunes en los laboratorios debido a su utilidad para presentar estadísticas de datos que indican múltiples contribuyentes, así como a su uso en software de genotipado probabilístico que predice las combinaciones de alelos más probables a partir de un conjunto de datos.

El inconveniente de utilizar razones de verosimilitud radica en la dificultad de comprender cómo los analistas llegaron a un valor específico, y en la complejidad matemática que implican a medida que se incorporan más datos a las ecuaciones. Para mitigar estos problemas en un entorno judicial, algunos laboratorios han establecido una "escala verbal" que sustituye el valor numérico real de la razón de verosimilitud.

Referencias

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