Experimento de Luria-Delbrück

El experimento de Luria-Delbrück (1943) (también conocido como la prueba de fluctuación ) demostró que, en las bacterias , las mutaciones genéticas surgen en ausencia de presión selectiva, en lugar de ser una respuesta a ella. De este modo, se concluyó que la teoría de Darwin sobre la selección natural que actúa sobre mutaciones aleatorias se aplica tanto a las bacterias como a organismos más complejos. Max Delbrück y Salvador Luria recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1969 , en parte por este trabajo.

Supongamos que se introduce una sola bacteria en un medio de cultivo rico en nutrientes y se le permite crecer durante${\displaystyle N\times }$de su tiempo de duplicación, obtendríamos${\displaystyle 2^{N}}$descendencia. Luego, introducimos un desafío con bacteriófagos. Esto mataría a la mayoría de las bacterias, pero dejaría algunas vivas. Después, podemos extender el medio de cultivo sobre un nuevo medio de cultivo y contar el número de colonias como el número de supervivientes.

En el escenario lamarckiano, cada bacteria se enfrenta al desafío sola. La mayoría perecería, pero algunas sobrevivirían y fundarían una nueva colonia. En el escenario darwiniano, la resistencia al fago se desarrollaría aleatoriamente durante la replicación. Aquellas que heredaran la resistencia sobrevivirían, mientras que las que no, morirían.

En el escenario lamarckiano, suponiendo que cada bacteria tiene una probabilidad de supervivencia igualmente pequeña, entonces el número de nuevas colonias sigue una distribución de Poisson, que disminuye exponencialmente a medida que aumenta el número de supervivientes.

En el escenario darwiniano, suponiendo que la probabilidad de mutación es lo suficientemente pequeña como para que esperemos solo una única mutación durante toda la fase de replicación, y que, por simplicidad, realmente obtenemos solo una única mutación, entonces con probabilidad${\displaystyle 1/2}$Hay un único superviviente, con probabilidad${\displaystyle 1/4}$Hay 2 supervivientes, etc. Es decir, la probabilidad aumenta como${\displaystyle {\frac {1}{\text{número de supervivientes}}}}$.

En particular, si la distribución del número de supervivientes decae más como una ley de potencias que como una exponencial, entonces podemos concluir con alta probabilidad estadística que el escenario darwiniano es cierto. Esta es una descripción general del experimento de Luria-Delbrück. (Sección 4.4 ^{[ 1 ]} )

En la década de 1940, las ideas de herencia y mutación eran generalmente aceptadas, aunque el papel del ADN como material hereditario aún no se había establecido. Se pensaba que las bacterias eran de alguna manera diferentes y podían desarrollar mutaciones genéticas hereditarias dependiendo de las circunstancias en las que se encontraran: en resumen, ¿era la mutación en las bacterias preadaptativa (preexistente) o postadaptativa (adaptación dirigida)? ^{[ 2 ]}

En su experimento, Luria y Delbrück inocularon una pequeña cantidad de bacterias ( Escherichia coli ) en tubos de cultivo separados . Tras un período de crecimiento, sembraron volúmenes iguales de estos cultivos en agar que contenía el fago T1 (virus). Si la resistencia al virus en las bacterias se debiera a una activación inducida en las bacterias, es decir, si la resistencia no se debiera a componentes genéticos hereditarios, entonces cada placa debería contener aproximadamente el mismo número de colonias resistentes. Suponiendo una tasa de mutación constante, Luria hipotetizó que si las mutaciones ocurrían después y en respuesta a la exposición al agente selectivo, el número de supervivientes se distribuiría según una distribución de Poisson con una media igual a la varianza . Esto no fue lo que encontraron Delbrück y Luria: en cambio, el número de colonias resistentes en cada placa varió drásticamente: la varianza fue considerablemente mayor que la media.

Luria y Delbrück propusieron que estos resultados podrían explicarse por la ocurrencia de una tasa constante de mutaciones aleatorias en cada generación de bacterias que crecían en los tubos de cultivo iniciales. Basándose en estas suposiciones, Delbrück derivó una distribución de probabilidad (ahora llamada distribución de Luria-Delbrück ^{[ 3 ] [ 4 ]} ) que establece una relación entre los momentos consistente con los valores obtenidos experimentalmente. Por lo tanto, la conclusión fue que las mutaciones en las bacterias, al igual que en otros organismos, son aleatorias y no dirigidas. ^{[ 5 ]}

Los resultados de Luria y Delbrück fueron confirmados de una manera más gráfica, pero menos cuantitativa, por Newcombe. Newcombe incubó bacterias en una placa de Petri durante unas horas y luego las replicó en dos nuevas placas de Petri tratadas con fagos. La primera placa se dejó sin extender, y la segunda se redistribuyó, es decir, se movieron las células bacterianas permitiendo que células individuales de algunas colonias formaran nuevas colonias. Si las colonias contenían células bacterianas resistentes antes de entrar en contacto con el virus fago, cabría esperar que algunas de estas células formaran nuevas colonias resistentes en la placa redistribuida y, por lo tanto, encontrar allí un mayor número de bacterias supervivientes. Cuando ambas placas se incubaron para el crecimiento, se observó un número de colonias bacterianas hasta 50 veces mayor en la placa redistribuida. Esto demostró que las mutaciones bacterianas a la resistencia al virus se habían producido aleatoriamente durante la primera incubación. Una vez más, las mutaciones se produjeron antes de que se aplicara la selección. ^{[ 6 ]}

Más recientemente, los resultados de Luria y Delbrück fueron cuestionados por Cairns y otros, quienes estudiaron mutaciones en el metabolismo de los azúcares como una forma de estrés ambiental. ^{[ 7 ]} Algunos científicos sugieren que este resultado podría deberse a la selección para la amplificación genética y/o a una mayor tasa de mutación en células incapaces de dividirse. ^{[ 8 ]} Otros han defendido la investigación y proponen mecanismos que explican los fenómenos observados, consistentes con la mutagénesis adaptativa . ^{[ 9 ]}

Esta distribución parece haber sido determinada por primera vez por Haldane . ^{[ 10 ]} En 1991 se descubrió en el University College London un manuscrito inédito que describía esta distribución. La derivación es diferente, pero los resultados son difíciles de calcular sin el uso de una computadora.

Se utiliza un pequeño número de células para inocular cultivos paralelos en un medio no selectivo. ^{[ 11 ]} Los cultivos se cultivan hasta la saturación para obtener densidades celulares iguales. Las células se siembran en medios selectivos para obtener el número de mutantes ( r ). Se siembran diluciones en medio rico para calcular el número total de células viables ( N _t ). El número de mutantes que aparecen en el cultivo saturado es una medida tanto de la tasa de mutación como del momento en que surgen los mutantes durante el crecimiento del cultivo: los mutantes que aparecen al principio del crecimiento del cultivo propagarán muchos más mutantes que los que surgen más tarde durante el crecimiento. Estos factores hacen que la frecuencia ( r / N _t ) varíe mucho, incluso si el número de eventos mutacionales ( m ) es el mismo. La frecuencia no es una medida suficientemente precisa de mutación y siempre se debe calcular la tasa de mutación ( m / N _t ).

La estimación de la tasa de mutación ( μ ) es compleja. Luria y Delbrück estimaron este parámetro a partir de la media de la distribución, pero posteriormente se demostró que este estimador estaba sesgado.

El método de Lea-Coulson para la mediana se introdujo en 1949. ^{[ 12 ]} Este método se basa en la ecuación

${\displaystyle {\frac {r}{m}}-\ln(m)-1.24=0.}$

dónde:

r = número mediano de colonias en una placa que contiene el indicador (por ejemplo, rifampicina, clorato de sodio, estreptomicina)

m = una variable que se variará, corresponde a las mutaciones/cultura

El valor de la variable m se ajusta hasta que el valor total de la ecuación se aproxime a 0. Entonces, la tasa de mutación (probabilidad de una mutación/célula/división o generación) se puede calcular mediante una de tres fórmulas:

(1)${\displaystyle \mu =m/{\operatorname {median} (N_{t})}}$

(2)${\displaystyle \mu =m/(2\operatorname {median} (N_{t}))}$

(3)${\displaystyle \mu =m\ln(2)/{\operatorname {median} (N_{t})}}$

donde N _t es la mediana del número de células viables en una placa sin indicador (a menudo agar LB sin aditivo).

La elección de la fórmula a utilizar depende de en qué etapa de la división celular se espera que ocurran las mutaciones. ^{[ 13 ]}

Este método se ha perfeccionado posteriormente, pero estos métodos más precisos son complejos. El estimador de máxima verosimilitud de Ma-Sandri-Sarkar es actualmente el mejor estimador conocido . ^{[ 14 ]} Se han descrito varios métodos adicionales y estimaciones a partir de datos experimentales. ^{[ 15 ]}

Dos aplicaciones web para el cálculo de la tasa de mutación están disponibles gratuitamente: Falcor ^{[ 11 ]} y bz-rates . Bz-rates implementa una versión generalizada del estimador de máxima verosimilitud de Ma-Sandri-Sarkar que puede tener en cuenta la tasa de crecimiento diferencial relativa entre células mutantes y de tipo silvestre, así como un estimador de función generadora que puede estimar tanto la tasa de mutación como la tasa de crecimiento diferencial. En este artículo de Jones et al . ^{[ 16 ] se muestra un ejemplo práctico.}

En todos estos modelos, se asumió que la tasa de mutación ( μ ) y la tasa de crecimiento ( β ) eran constantes. El modelo se puede generalizar fácilmente para flexibilizar estas y otras restricciones. ^{[ 17 ]} Es probable que estas tasas difieran en entornos no experimentales. Los modelos también requieren que N _t μ >> 1, donde N _t es el número total de organismos. Es probable que esta suposición se cumpla en la mayoría de los entornos realistas o experimentales.

Luria y Delbrück ^{[ 5 ]} estimaron la tasa de mutación (mutaciones por bacteria por unidad de tiempo) a partir de la ecuación

${\displaystyle \mu ={\frac {\beta \ln(\rho )}{n_{0}[1-\exp(\beta t)]}}}$

donde β es la tasa de crecimiento celular, n ₀ es el número inicial de bacterias en cada cultivo, t es el tiempo y

${\displaystyle \rho ={\frac {N_{s}}{N}}}$

donde N _s es el número de cultivos sin bacterias resistentes y N es el número total de cultivos.

El modelo de Lea y Coulson ^{[ 12 ]} se diferenciaba del original en que consideraba una colección de procesos de Yule independientes (un proceso de Poisson filtrado ). Las comparaciones numéricas de estos dos modelos con valores realistas de los parámetros han demostrado que difieren solo ligeramente. ^{[ 18 ]} La función generadora para este modelo fue hallada por Bartlett en 1978 ^{[ 19 ]} y es

${\displaystyle G(z,\mu ,\varphi )=\exp \left({\frac {\mu }{\varphi }}\left({\frac {1}{z}}-1\right)\log \left(1-\varphi z\right)\right)}$

donde μ es la tasa de mutación (que se supone constante), φ = 1 − e ^{− βt} con β como la tasa de crecimiento celular (que también se supone constante) y t como el tiempo.

La determinación de μ a partir de esta ecuación ha resultado difícil, pero se encontró una solución en 2005. La diferenciación de la función generadora con respecto a μ permite la aplicación del método de Newton-Raphson , que junto con el uso de una función de puntuación permite obtener intervalos de confianza para μ . 

El mecanismo de resistencia al fago T1 parece deberse a mutaciones en el gen fhuA , una proteína de membrana que actúa como receptor de T1. ^{[ 20 ]} El producto del gen tonB también es necesario para la infección por T1. La proteína FhuA participa activamente en el transporte de ferrichromo , albomicina y rifamicina . ^{[ 21 ]} También confiere sensibilidad a la microcina J25 y a la colicina M , y actúa como receptor para los fagos T5 y phi80, así como para T1.

La proteína FhuA tiene un dominio de barril beta (residuos 161 a 714) que está cerrado por un dominio globular de corcho (residuos 1 a 160). ^{[ 22 ]} Dentro del dominio de corcho se encuentra la región de unión a TonB (residuos 7 a 11). Los grandes dominios monoméricos de barril beta que atraviesan la membrana tienen 22 hebras beta de longitud variable, varias de las cuales se extienden significativamente más allá del núcleo hidrofóbico de la membrana hacia el espacio extracelular. Hay 11 bucles extracelulares numerados del L1 al L11. El bucle L4 es donde se une el fago T1.

• En el laboratorio de mutaciones
• La naturaleza de la mutación: un legado de la genética bacteriana
• Perfiles en la ciencia: Los documentos de Salvador E. Luria. Información sobre Salvador Luria de la Biblioteca Nacional de Medicina.