Proteólisis paralela rápida

La proteólisis paralela rápida ( FASTpp ) es un método para determinar la termoestabilidad de las proteínas midiendo qué fracción de la proteína resiste la digestión proteolítica rápida. ^{[ 1 ]}

La proteólisis se utiliza ampliamente en bioquímica y biología celular para investigar la estructura de las proteínas . ^{[ 2 ] [ 3 ]} En la "proteólisis limitada con tripsina", pequeñas cantidades de proteasa digieren tanto proteínas plegadas como desplegadas, pero a velocidades muy diferentes: las proteínas no estructuradas se cortan más rápidamente, mientras que las proteínas estructuradas se cortan a una velocidad más lenta (a veces por órdenes de magnitud). Recientemente, se han propuesto varios otros ensayos de estabilidad de proteínas basados ​​en la proteólisis, que aprovechan otras proteasas con alta especificidad para cortar proteínas desplegadas. Estos incluyen la proteólisis pulsada, ^{[ 4 ]} la calorimetría de escaneo proteolítico ^{[ 5 ]} y FASTpp.

FASTpp mide la cantidad de proteína que resiste la digestión bajo diversas condiciones. Para ello, se utiliza una proteasa termoestable que corta específicamente en residuos hidrofóbicos expuestos . El ensayo FASTpp combina el despliegue térmico, la especificidad de una proteasa termoestable para la fracción desplegada con el poder de separación de SDS-PAGE . ^{[ 6 ]} Gracias a esta combinación, FASTpp puede detectar cambios en la fracción plegada en un amplio rango de condiciones fisicoquímicas, incluyendo temperaturas de hasta 85  °C, pH 6–9, presencia o ausencia del proteoma completo . Sus aplicaciones abarcan desde la biotecnología hasta el estudio de mutaciones puntuales y ensayos de unión de ligandos .

FASTpp se ha utilizado para investigar: ^{[ 1 ]}

• Efecto del lisado sobre la estabilidad de las proteínas
• Estabilidad térmica del proteoma ^{[ 7 ]}
• Plegamiento y unión acoplados ^{[ 8 ]}
• Efectos de los ligandos sobre la fracción plegada y la estabilidad ^{[ 9 ]}
• Efectos de las mutaciones en la fracción plegada y la estabilidad (por ejemplo, mutaciones puntuales / mutaciones de sentido erróneo ^{[ 9 ] [ 10 ]} )
• Estabilidad cinética de las proteínas ^{[ 11 ]}

En primer lugar, se genera un lisado celular mediante agitación con perlas de vidrio, homogeneización por presión o métodos de lisis química o física que no desnaturalizan la(s) proteína(s) de interés. (Opcionalmente, para análisis dirigidos) la proteína de interés se purifica a partir de este lisado mediante métodos de afinidad basados ​​en etiquetas intrínsecamente desordenadas ^{[ 12 ]} u otras estrategias de purificación adecuadas, que a menudo implican varias etapas cromatográficas ortogonales.

Esta solución proteica (total o purificada) se divide en alícuotas en varios tubos de una tira de PCR. Todas las alícuotas se exponen en paralelo en un termociclador de gradiente térmico a diferentes temperaturas máximas en presencia de la proteasa termoestable termolisina (véase la figura). El control automático de la temperatura se logra en un termociclador de gradiente térmico (comúnmente utilizado para PCR ). Los productos de la reacción se pueden separar mediante SDS-PAGE o Western blot . ^{[ 6 ]} La proteasa termolisina se puede inactivar completamente con EDTA . Esta característica de la termolisina hace que FASTpp sea compatible con la digestión posterior con tripsina, por ejemplo, para espectrometría de masas . ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 7 ]}