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Empalme de proteínas

Mecanismo de empalme de proteínas que involucra inteínas. En este esquema, la N-exteína se muestra en rojo, la inteína en negro y la C-exteína en azul. X representa un átomo de ...

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Mecanismo de empalme de proteínas que involucra inteínas
Mecanismo de empalme de proteínas que involucra inteínas. En este esquema, la N-exteína se muestra en rojo, la inteína en negro y la C-exteína en azul. X representa un átomo de oxígeno o de azufre.

El empalme de proteínas es una reacción intramolecular de una proteína en particular en la que un segmento proteico interno (llamado inteína ) se elimina de una proteína precursora mediante la unión de proteínas externas (llamadas exteínas ) en los extremos C y N-terminal . La unión de empalme de la proteína precursora es principalmente una cisteína o una serina , aminoácidos que contienen una cadena lateral nucleofílica . Las reacciones de empalme de proteínas conocidas actualmente no requieren cofactores exógenos ni fuentes de energía como el trifosfato de adenosina (ATP) o el trifosfato de guanosina (GTP). Normalmente, el empalme se asocia únicamente con el empalme del pre-ARNm . Esta proteína precursora contiene tres segmentos: una exteína N, seguida de la inteína y, finalmente, de una exteína C. Tras el empalme, la proteína resultante contiene la exteína N unida a la exteína C; este producto de empalme también se denomina exteína.

Historia

La primera inteína se descubrió en 1988 mediante la comparación de secuencias entre la ATPasa vacuolar de Neurospora crassa [ 1 ] y zanahoria [ 2 ] (sin inteína) y el gen homólogo en levadura (con inteína) que se describió inicialmente como un supuesto transportador de iones de calcio . [ 3 ] En 1990 Hirata et al. [ 4 ] demostraron que la secuencia adicional en el gen de levadura se transcribía en ARNm y se eliminaba de la proteína huésped solo después de la traducción. Desde entonces, se han encontrado inteínas en los tres dominios de la vida ( eucariotas , bacterias y arqueas ) y en virus .

El empalme de proteínas fue inesperado y sus mecanismos fueron descubiertos por dos grupos (Anraku [ 5 ] y Stevens [ 6 ] ) en 1990. Ambos descubrieron una VMA1 de Saccharomyces cerevisiae en un precursor de una enzima H + -ATPasa vacuolar . La secuencia de aminoácidos de los extremos N y C correspondía al 70% de la secuencia de ADN de una H + -ATPasa vacuolar de otros organismos, mientras que la secuencia de aminoácidos de la posición central correspondía al 30% de la secuencia total de ADN de la nucleasa HO de levadura .

Muchos genes tienen segmentos codificantes de inteínas no relacionados insertados en diferentes posiciones. Por estas y otras razones, las inteínas (o, más propiamente, los segmentos genéticos que las codifican) a veces se denominan elementos genéticos egoístas , pero podría ser más preciso llamarlos parásitos . Según la visión de la evolución centrada en los genes, la mayoría de los genes son "egoístas" solo en la medida en que compiten con otros genes o alelos , pero generalmente cumplen una función para los organismos, mientras que los "elementos genéticos parásitos", al menos inicialmente, no hacen una contribución positiva a la aptitud del organismo. [ 7 ] [ 8 ]

A diciembre de 2019, la base de datos UniProtKB contiene 188 entradas anotadas manualmente como inteínas, que van desde solo decenas de residuos de aminoácidos hasta miles. [ 9 ] La primera inteína se encontró codificada dentro del gen VMA de Saccharomyces cerevisiae . Posteriormente se encontraron en hongos ( ascomicetos , basidiomicetos , zigomicetos y quitridios ) y también en diversas proteínas. Se ha descrito una proteína distantemente relacionada con las proteínas que contienen inteínas conocidas, pero estrechamente relacionada con las proteínas hedgehog de metazoos , que tiene la secuencia de inteína de Glomeromycota . Muchas de las inteínas recientemente descritas contienen endonucleasas de homing y algunas de ellas son aparentemente activas. [ 10 ] La abundancia de inteínas en hongos indica transferencia lateral de genes que contienen inteínas. Mientras que en eubacterias y arqueas, hay 289 y 182 inteínas actualmente conocidas. Como era de esperar, la mayoría de las inteínas en eubacterias y arqueas se encuentran insertadas en proteínas metabólicas de ácidos nucleicos, como en los hongos. [ 10 ]

Las inteínas varían enormemente, pero muchas de las mismas proteínas que contienen inteínas se encuentran en varias especies. Por ejemplo, la proteína factor de procesamiento de pre-ARNm 8 (Prp8), fundamental en el espliceosoma , tiene siete sitios de inserción de inteína diferentes en especies eucariotas. [ 11 ] La Prp8 que contiene inteínas se encuentra más comúnmente en hongos, pero también se observa en Amoebozoa , Chlorophyta , Capsaspora y Choanoflagellida . Muchas micobacterias contienen inteínas dentro de DnaB (helicasa replicativa bacteriana), RecA (recombinasa de ADN bacteriana) y SufB ( proteína de ensamblaje del clúster FeS ). [ 12 ] [ 13 ] Existe una notable variedad en la estructura y el número de inteínas DnaB, tanto dentro del género Mycobacterium como fuera de él. Curiosamente, DnaB que contiene inteínas también se encuentra en los cloroplastos de las algas. [ 14 ] Las proteínas que contienen inteínas encontradas en arqueas incluyen RadA (homólogo de RecA), RFC, PolB y RNR. [ 15 ] Muchas de las mismas proteínas que contienen inteínas (o sus homólogos) se encuentran en dos o incluso en los tres dominios de la vida. Las inteínas también se observan en los proteomas codificados por bacteriófagos y virus eucariotas. Los virus podrían haber participado como vectores de distribución de inteínas en la amplia variedad de organismos que las contienen. [ 15 ]

Mecanismo

El proceso para las inteínas de clase 1 comienza con un cambio NO o NS cuando la cadena lateral del primer residuo (una serina , treonina o cisteína ) de la porción de inteína de la proteína precursora ataca nucleofílicamente el enlace peptídico del residuo inmediatamente anterior (es decir, el residuo final de la N-exteína) para formar un intermedio éster lineal (o tioéster ). Una transesterificación ocurre cuando la cadena lateral del primer residuo de la C-exteína ataca el (tio)éster recién formado para liberar el extremo N-terminal de la inteína. Esto forma un intermedio ramificado en el que la N-exteína y la C-exteína están unidas, aunque no a través de un enlace peptídico. El último residuo de la inteína es siempre una asparagina (Asn), y el átomo de nitrógeno amida de esta cadena lateral rompe el enlace peptídico entre la inteína y la C-exteína, lo que resulta en un segmento de inteína libre con una imida cíclica terminal . Finalmente, el grupo amino libre de la C-exteína ataca el (tio)éster que une las N- y C-exteínas. Un cambio ON o SN produce un enlace peptídico y la proteína funcional ligada . [ 16 ]

Las inteínas de clase 2 no tienen una primera cadena lateral nucleofílica, solo una alanina. En cambio, la reacción comienza directamente con un desplazamiento nucleofílico, donde el primer residuo de la C-exteína ataca el carboxilo peptídico del último residuo de la N-exteína. El resto procede como de costumbre, comenzando con la Asn transformándose en una imida cíclica. [ 17 ]

Las inteínas de clase 3 no tienen una primera cadena lateral nucleofílica, solo una alanina, pero poseen un motivo interno no contiguo "WCT". El residuo interno C (cisteína) ataca el carboxilo peptídico del último residuo de la N-exteína (desplazamiento nucleofílico). La transesterificación ocurre cuando el primer residuo de la C-exteína ataca el tioéster recién formado. El resto transcurre como de costumbre. [ 18 ]

El mecanismo del efecto de empalme es una analogía natural de la técnica para generar químicamente proteínas de tamaño mediano llamada ligación química nativa .

Inteína

Una inteína es un segmento de una proteína que puede escindirse y unirse a las porciones restantes (las exteínas ) con un enlace peptídico durante el empalme de proteínas. [ 19 ] Las inteínas también se han denominado intrones de proteínas , por analogía con los intrones (de ARN) .

El empalme de inteínas se produce postraduccionalmente mediante un proceso autocatalítico. Aquí, la exteína se muestra en rojo y la inteína en azul.

Convenciones de nomenclatura

La primera parte del nombre de una inteína se basa en el nombre científico del organismo en el que se encuentra, y la segunda parte en el nombre del gen o exteína correspondiente. Por ejemplo, la inteína que se encuentra en Thermoplasma acidophilum y que está asociada con la subunidad A de la ATPasa vacuolar (VMA) se llama "Tac VMA".

Normalmente, como en este ejemplo, bastan tres letras para especificar el organismo, pero existen variaciones. Por ejemplo, se pueden añadir letras adicionales para indicar una cepa. Si el gen correspondiente codifica más de una inteína, se les asigna un sufijo numérico que va del 5 ′ al 3 ′ o en orden de identificación (por ejemplo, "Msm dnaB-1").

El segmento del gen que codifica la inteína suele recibir el mismo nombre que la inteína, pero para evitar confusiones, el nombre de la inteína propiamente dicha suele escribirse con mayúscula inicial ( p. ej. , Pfu RIR1-1), mientras que el nombre del segmento genético correspondiente se escribe en cursiva ( p. ej. , Pfu rir1-1 ). Otra convención para desambiguar el nombre consiste en colocar una "i" minúscula después del nombre de la proteína de origen, p. ej. , "Msm DnaBi1". [ 20 ]

Tipos de inteínas

Las inteínas se pueden clasificar según muchos criterios.

  • Según cómo se autoescinden, se pueden clasificar en cis-splicing (lo que significa que se autoescinden) o trans-splicing (lo que significa que necesitan ayuda externa). La mayoría de las inteínas estudiadas son cis-splicing. Las inteínas divididas (véase más abajo) generalmente implican dos mitades que se ayudan mutuamente, por lo que son trans-splicing . [ 17 ]
  • Según contengan o no el dominio endonucleasa. Aquellas que tienen un dominio endonucleasa se denominan "maxi-inteínas", de lo contrario, "mini-inteínas". [ 17 ]
  • Basándose en su mecanismo de empalme, que puede inferirse parcialmente [ 18 ] a partir de la secuencia. La inteína de clase 1 es el tipo más estudiado y se caracteriza por tener una cisteína o serina como primer residuo. La inteína de clase 2, o "inteína de alanina", tiene alanina como primer residuo y carece de motivo WCT. La inteína de clase 3 tiene alanina como primer residuo y un motivo "WCT" no contiguo. [ 17 ] También se ha propuesto que las inteínas que comienzan con una serina y contienen un motivo "WCT" también deberían clasificarse como clase 3. [ 18 ]

Inteínas completas y mini

Las inteínas pueden contener un dominio de gen de endonucleasa de homing (HEG) además de los dominios de empalme. Este dominio es responsable de la propagación de la inteína al cortar el ADN en un alelo libre de inteína en el cromosoma homólogo , lo que activa el sistema de reparación de roturas de doble cadena del ADN (DSBR), que luego repara la rotura, copiando así el ADN que codifica la inteína en un sitio previamente libre de inteína. [ 17 ] El dominio HEG no es necesario para el empalme de la inteína, por lo que puede perderse, formando una inteína mínima o mini . Varios estudios han demostrado la naturaleza modular de las inteínas al agregar o eliminar dominios HEG y determinar la actividad de la nueva construcción.

inteínas divididas

En ocasiones, la inteína de la proteína precursora proviene de dos genes. En este caso, se dice que la inteína es una inteína dividida . Por ejemplo, en las cianobacterias , DnaE , ​​la subunidad catalítica α de la ADN polimerasa III , está codificada por dos genes separados, dnaE-n y dnaE-c . El producto de dnaE-n consta de una secuencia N-exteína seguida de una secuencia de inteína de 123 aminoácidos, mientras que el producto de dnaE-c consta de una secuencia de inteína de 36 aminoácidos seguida de una secuencia C-exteína. [ 21 ]

Aplicaciones en biotecnología

Las inteínas son muy eficientes en el empalme de proteínas y, por consiguiente, desempeñan un papel importante en la biotecnología . Hasta la fecha, se han identificado más de 200 inteínas, con tamaños que oscilan entre 100 y 800 aminoácidos . Se han diseñado inteínas para aplicaciones específicas, como la semisíntesis de proteínas [ 22 ] y el marcaje selectivo de segmentos proteicos, lo cual resulta útil para estudios de RMN de proteínas grandes [ 23 ] .

La inhibición farmacológica de la escisión de inteínas puede ser una herramienta útil para el desarrollo de fármacos ; la proteína que contiene la inteína no podrá desempeñar su función normal si la inteína no se escinde, ya que su estructura se verá alterada.

Se ha sugerido que las inteínas podrían ser útiles para lograr la expresión alotópica de ciertas proteínas altamente hidrofóbicas normalmente codificadas por el genoma mitocondrial , por ejemplo, en terapia génica . [ 24 ] La hidrofobicidad de estas proteínas es un obstáculo para su importación a las mitocondrias. Por lo tanto, la inserción de una inteína no hidrofóbica podría permitir que esta importación se lleve a cabo. La escisión de la inteína después de la importación restauraría la proteína a su estado silvestre .

Las etiquetas de afinidad se han utilizado ampliamente para purificar proteínas recombinantes, ya que permiten la acumulación de proteína recombinante con pocas impurezas. Sin embargo, la etiqueta de afinidad debe eliminarse mediante proteasas en el paso final de purificación. El paso adicional de proteólisis plantea problemas de especificidad de la proteasa al eliminar las etiquetas de afinidad de la proteína recombinante y la eliminación del producto de digestión. Este problema puede evitarse fusionando una etiqueta de afinidad a inteínas autoclivables en un entorno controlado. La primera generación de vectores de expresión de este tipo utilizó la inteína VMA modificada de Saccharomyces cerevisiae (Sce VMA). Chong et al. [ 25 ] utilizaron un dominio de unión a quitina (CBD) de Bacillus circulans como etiqueta de afinidad y fusionaron esta etiqueta con una inteína Sce VMA modificada. La inteína modificada sufre una reacción de autocorte en su enlace peptídico N-terminal con 1,4-ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol (β-ME) o cistina a bajas temperaturas en un amplio rango de pH. Tras la expresión de la proteína recombinante, el homogeneizado celular se pasa a través de una columna que contiene quitina . Esto permite que el CBD de la proteína quimérica se una a la columna. Además, cuando se reduce la temperatura y las moléculas descritas anteriormente pasan a través de la columna, la proteína quimérica sufre un autoescisión y solo se eluye la proteína diana. Esta novedosa técnica elimina la necesidad de una etapa de proteólisis, y la Sce VMA modificada permanece en la columna unida a la quitina a través del CBD. [ 25 ]

Recientemente, se han utilizado inteínas para purificar proteínas basadas en péptidos autoagregantes. Los polipéptidos similares a la elastina (ELP) son una herramienta útil en biotecnología. Fusionados con la proteína diana, tienden a formar agregados dentro de las células. [ 26 ] Esto elimina el paso cromatográfico necesario en la purificación de proteínas. Las etiquetas ELP se han utilizado en la proteína de fusión de la inteína, de modo que los agregados se pueden aislar sin cromatografía (por centrifugación) y luego la inteína y la etiqueta se pueden escindir de manera controlada para liberar la proteína diana en solución. Este aislamiento de proteínas se puede realizar utilizando un flujo continuo de medio, lo que produce altas cantidades de proteína, haciendo que este proceso sea más eficiente económicamente que los métodos convencionales. [ 26 ] Otro grupo de investigadores utilizó etiquetas autoagregantes más pequeñas para aislar la proteína diana. Se utilizaron los pequeños péptidos anfipáticos 18A y ELK16 (figura 5) para formar proteínas agregantes autoescindibles. [ 27 ]

Aplicaciones en el desarrollo de antimicrobianos

En los últimos veinte años, ha habido un creciente interés en aprovechar las inteínas para aplicaciones antimicrobianas . [ 12 ] El empalme de inteínas se encuentra exclusivamente en organismos unicelulares, con una abundancia particularmente alta en microorganismos patógenos. [ 28 ] Además, las inteínas se encuentran comúnmente dentro de proteínas de mantenimiento y/o proteínas involucradas en la supervivencia del organismo dentro de un huésped humano. La eliminación postraduccional de la inteína es necesaria para que la proteína se pliegue y funcione correctamente. Por ejemplo, Gaëlle Huet et al. demostraron que en Mycobacterium tuberculosis , SufB no empalmado impide la formación del complejo SufBCD, un componente de la maquinaria SUF. [ 29 ] Por lo tanto, la inhibición del empalme de inteínas puede servir como una plataforma poderosa para el desarrollo de antimicrobianos.

La investigación actual sobre inhibidores del empalme de inteínas se ha centrado en el desarrollo de antimicobacterianos ( M. tb. tiene tres proteínas que contienen inteínas), así como agentes activos contra los hongos patógenos Cryptococcus y Aspergillus. [ 13 ] El cisplatino y compuestos similares que contienen platino inhiben el empalme de la inteína RecA de M. tb. mediante la coordinación con residuos catalíticos. [ 30 ] Los cationes divalentes, como los iones de cobre (II) y zinc (II), funcionan de manera similar para inhibir reversiblemente el empalme. [ 12 ] Sin embargo, ninguno de estos métodos es actualmente adecuado para un antibiótico eficaz y seguro. La inteína fúngica Prp8 también es inhibida por cationes divalentes y cisplatino mediante la interferencia con el residuo catalítico Cys1. [ 12 ] En 2021, Li et al. demostraron que los inhibidores de moléculas pequeñas del empalme de la inteína Prp8 eran selectivos y eficaces para ralentizar el crecimiento de C. neoformans y C. gattii , lo que proporciona evidencia prometedora del potencial antimicrobiano de los inhibidores del empalme de inteínas. [ 31 ]

Véase también

Referencias

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  29. ↑ Huet, Gaëlle; Castaing, Jean-Philippe; Fournier, Didier; Daffé, Mamadou; Saves, Isabelle (mayo de 2006). " El empalme de proteínas de SufB es crucial para la funcionalidad de la maquinaria SUF de Mycobacterium tuberculosis" . Journal of Bacteriology . 188 (9): 3412–3414 . doi : 10.1128/JB.188.9.3412-3414.2006 . ISSN 0021-9193 . PMC 1447444. PMID 16621837 .   
  30. ↑ Chan, Hon; Pearson, C. Seth; Green, Cathleen M.; Li, Zhong; Zhang, Jing; Belfort, Georges; Shekhtman, Alex; Li, Hongmin; Belfort, Marlene (octubre de 2016). "Explorando la inhibición de inteínas por compuestos de platino como estrategia antimicrobiana" . Journal of Biological Chemistry . 291 (43): 22661– 22670. doi : 10.1074/jbc.m116.747824 . ISSN 0021-9258 . PMC 5077202. PMID 27609519 .   
  31. ↑ Li, Zhong; Tharappel, Anil Mathew; Xu, Jimin; Lang, Yuekun; Green, Cathleen M.; Zhang, Jing; Lin, Qishan; Chaturvedi, Sudha; Zhou, Jia; Belfort, Marlene; Li, Hongmin (2021-01-12). "Inhibidores de moléculas pequeñas para la inteína Prp8 como agentes antifúngicos" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 118 (2) e2008815118. Bibcode : 2021PNAS..11808815L . doi : 10.1073/pnas.2008815118 . ISSN 0027-8424 . PMC 7812778. PMID 33397721 .   

Lecturas adicionales

  • Gogarten, J Peter; Elena Hilario (2006). "Inteínas, intrones y endonucleasas de homing: revelaciones recientes sobre el ciclo de vida de los elementos genéticos parásitos" . BMC Evol Biol . 6 (1): 94. doi : 10.1186/1471-2148-6-94 . ISSN 1471-2148 . PMC 1654191. PMID 17101053 .   
  • La base de datos Intein
  • Base de datos Intein de Shmuel Pietrokovski
  • Breve reseña
  • Starokadomskyy PL. Empalme de proteínas, 2007
  • Mecanismo de empalme de proteínas y estructura de las inteínas
  • Proteína + Empalme en los Encabezamientos de Materia Médica (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.