Factor de terminación de la traducción eucariota 1

La proteína eRF1 está compuesta por una cadena polipeptídica de aminoácidos con forma de Y. La proteína se compone de 3 dominios principales: un tallo y 2 ramificaciones. Cada dominio tiene una función específica y un patrón de plegamiento distinto que permite que la proteína funcione correctamente. Si bien cada dominio es único, todos contienen la estructura básica de una clase de sándwich α-β, que es esencialmente un núcleo de lámina β rodeado de hélices α . El dominio 1, a veces denominado dominio N, está construido a partir de un núcleo de lámina β con 4 hebras rodeadas por 2 hélices α (α2 y α3). Las subunidades α2 y α3 se enrollan y se unen para formar una estructura en horquilla que contiene el motivo NIKS, ^{[ 8 ]} el motivo YxxCxxxF y el bucle GTS. ^{[ 9 ]} Se hipotetiza que estos sitios son el apéndice principal en el reconocimiento del codón de parada. Además, el extremo N se localiza en el Dominio 1, que interactúa con el Dominio 3 para mantener la estabilidad de la proteína. El Dominio 3, a veces denominado dominio C, contiene el extremo C del polipéptido. Asimismo, la estructura y función del Dominio 3, denominado dominio M, son las menos conocidas, ya que las limitaciones ópticas dificultan la investigación. El Dominio 2 consiste en una estructura tipo sándwich α-β, donde una de las hebras externas carece de estructura secundaria. La sección de aminoácidos primarios permite la formación del sitio GGQ. ^{[ 8 ]}

La estructura plegada de eRF1 imita esencialmente la estructura de una molécula de ARNt . Esto asegura que la maquinaria de eRF1 encaje en el sitio aminoacilo del ribosoma. eRF1 también tiene la capacidad de reconocer codones, que es uno de los procesos importantes llevados a cabo por las moléculas de ARNt. ^{[ 10 ]} Dado que tanto el ARNt como eRF1 tienen la capacidad de unirse al ARNm y al centro de peptidiltransferasa , tienen dimensiones similares, con eRF1 teniendo un ancho de 71 Å frente a los 70 Å del ARNt de fenilalanina. ^{[ 8 ] [ 11 ]} Ambas moléculas interactúan con GTPasas : eEF-1α ( EF-Tu en procariotas) con el ARNt y eRF3 con eRF1. ^{[ 8 ]}

El motivo en biología fisiológica entre la relación estructura-función está muy presente entre las moléculas de eRF1 y tRNA. El sitio GGQ en eRF1 es equivalente al grupo aminoacilo unido al tRNA. Ambas estructuras contribuyen al reconocimiento y unión del sitio peptidiltransferasa en el ribosoma. Ambas estructuras orientan el sitio altamente especializado lejos del resto de la molécula para asegurar una interacción aislada. Además, el dominio 2 de eRF1 es estructuralmente similar al tallo aminoacilo del tRNA. ^{[ 11 ]} Tanto el tallo T del tRNA como el dominio 3 de eRF1 cumplen la función de interactuar con proteínas GTPasa.

El motivo GGQ es una secuencia de aminoácidos conservada en los factores de liberación en todos los dominios de la vida. El sitio GGQ consta de dos aminoácidos de glicina seguidos de una glutamina . En eRF1, el sitio GGQ se encuentra en los residuos 183-185 del polipéptido, que se localiza en el Dominio 2. La orientación distante del sitio GGQ se estabiliza por los efectos hidrofóbicos de los residuos de aminoácidos vecinos, como la leucina 176, la prolina 177, la fenilalanina 190 y la leucina 193. Se cree que el residuo gln185 del motivo GGC es el principal sitio catalítico para la hidrólisis del enlace éster peptidil-ARNt en la peptidiltransferasa del ribosoma. El sitio GGQ no está asociado con ninguna función de reconocimiento de codón de parada, acoplamiento ribosomal o unión a eRF3. ^{[ 12 ] [ 8 ]}

El motivo NIKS es una secuencia de aminoácidos altamente conservada ubicada en el extremo N-terminal del dominio 1 (residuos de aminoácidos 61-64). El motivo NIKS contiene los aminoácidos asparagina (N), isoleucina (I), lisina (K) y serina (S). ^{[ 13 ]} La función principal del motivo NIKS es reconocer el primer nucleótido del codón de parada, que siempre es uracilo. Además, las mutaciones en esta región se han asociado con una disminución de la unión ribosomal y de la actividad catalítica. ^{[ 14 ]}

El motivo YxxCxxxF y el bucle GTS son dos sitios de aminoácidos ubicados en el Dominio 1 de eRF1. El motivo YxxCxxxF se encuentra en los residuos de aminoácidos 121-131, mientras que el bucle GTS se encuentra en los residuos de aminoácidos 31-33. El motivo YxxCxxxF está compuesto por tres residuos de aminoácidos invariantes: tirosina (Y), cisteína (C) y fenilalanina (F). Estos sitios están estructuralmente separados en la proteína eRF1 plegada, sin embargo, sus funciones principales son muy similares. Son responsables del reconocimiento de purinas en las posiciones 2 y 3 del codón de parada. ^{[ 15 ]}

La unión de eRF3 y GTP a eRF1 para formar un complejo es esencial para la terminación de la traducción. La interacción entre los dominios C de eRF1 y eRF3 es la principal fuerza que mantiene unido el complejo. ^{[ 17 ]} Sin embargo, posteriormente se descubrió que el dominio M también contribuye a la estabilidad del complejo. El posicionamiento de eRF3 cerca del motivo GGQ, que se encuentra en el dominio C, permite mayores efectos catalíticos de eRF1 en la hidrólisis del peptidil-ARNt. ^{[ 18 ]}

Cada dominio de la vida ( Eubacterias , Arqueas y Eucariotas ) posee diferentes factores de liberación asociados a la terminación de la traducción. Las Eubacterias tienen múltiples factores de liberación para reconocer los codones de parada, mientras que los Eucariotas (eRF1) y las Arqueas (aRF1) poseen una sola proteína para reconocer los tres codones de parada. Se cree que las diferencias estructurales y funcionales entre los factores de liberación de las Eubacterias y los de las Arqueas/Eucariotas evolucionaron de forma independiente, con un punto de divergencia temprano. Las similitudes funcionales entre eRF1 y aRF1 han dado lugar a teorías sobre un ancestro común del que evolucionaron ambas proteínas. ^{[ 19 ]} Sin embargo, se ha estudiado muy poco sobre los factores de liberación de las Arqueas. ^{[ 20 ]}

En procariotas, los factores de liberación se clasifican en dos clases. Los factores de liberación de clase 1 reconocen el codón de parada, y los de clase 2 estimulan la hidrólisis mediante la actividad GTPasa. Sin embargo, los procariotas no poseen una única proteína que reconozca todos los codones de parada. El codón de parada UAG es decodificado por el Factor de Liberación 1 (RF1) y el UGA por el Factor de Liberación 2. El último codón de parada, UAA, es decodificado tanto por RF1 como por RF2. ^{[ 21 ]} En eucariotas, eRF1 reconoce los tres codones de parada. ^{[ 22 ]}

Aunque existe una diferencia clara entre el reconocimiento de codones procariotas y el reconocimiento de codones arqueanos/eucariotas, la funcionalidad del sitio catalítico se conserva en todos los dominios. Cada dominio posee el sitio GGQ crítico para promover la hidrólisis de péptidos. ^{[ 23 ]}

El sitio NIKS es responsable de la unión con el primer nucleótido del codón de parada: uracilo. Esto se logra mediante la formación de enlaces de hidrógeno entre los residuos Asn61 y Lys63 de NIKS y el grupo carbonilo del uracilo. Se forma un enlace de hidrógeno secundario entre el residuo Asn61 y otro grupo carbonilo presente en el uracilo. Además, se ha planteado la hipótesis de que el residuo Lys63 interactúa con la cadena principal del ARNm, lo que contribuye a la estabilidad y al correcto alineamiento de eRF1. La especificidad del mecanismo para el uracilo implica que cualquier otro nucleótido (guanina, adenosina, timina, citosina) producirá una estructura que no presenta enlaces de hidrógeno extensos para estabilizar el acoplamiento de eRF1. ^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]}

Los nucleótidos de segunda y tercera posición son reconocidos por los sitios YxxCxxxF y GTS. Este proceso es muy importante porque le da a eRF1 la capacidad de discriminar el codón de parada de un codón de sentido de inicio de uracilo que codifica un aminoácido. ^{[ 28 ]} Por ejemplo, el aminoácido cisteína está codificado por el codón UGU. El primer paso para discriminar los codones de parada de los codones de sentido es distinguir las purinas de las pirimidinas, ya que todos los codones de parada tienen nucleótidos de purina en las posiciones +2 y +3. Dos residuos de aminoácidos altamente conservados, Glu55 y Tyr125 (ubicados en el motivo YxxCxxxF), trabajan en conjunto para formar enlaces de hidrógeno con el átomo de nitrógeno N6 en el nucleótido adenosina/guanina. Esta interacción excluye la posibilidad de pirimidinas en las posiciones +2 y +3. ^{[ 29 ] [ 30 ]}

Se requiere una mayor discriminación de las purinas en las posiciones +2 y +3, ya que UGG es un codón de sentido para el triptófano. En el caso de UGG, el residuo Glu55 es repelido por la fuerte carga negativa de los dos nucleótidos de guanina. Dado que no se produjo un enlace de hidrógeno extenso, el codón no se reconoce como un codón de parada. ^{[ 30 ]}

Un residuo muy importante en eRF1 es la Cys127 en el motivo YxxCxxxF, que forma dos enlaces de hidrógeno con un borde de Watson y Crick ubicado en el ARNm. Estos enlaces de hidrógeno permiten una mayor estabilidad del complejo eRF1-codón de parada en múltiples orientaciones y facilitan el apilamiento/enlace de hidrógeno de las posiciones +2 y +3 del codón de parada. La fuerza y ​​el número de apilamientos en la segunda y tercera posición permiten a eRF1 discriminar entre codones de parada y codones de sentido. ^{[ 30 ]}

El sitio GTS tiene la capacidad de adoptar dos conformaciones dependiendo de la interacción de la adenina o la guanina. Para el codón de parada UAG, la treonina 32 del sitio GTS formará un enlace de hidrógeno con la guanina en la posición +3. Si el codón de parada tiene guanina en la segunda posición (UGA), el motivo YxxCxxxF se apila sobre el codón, lo que provoca que el sitio GTS se oriente en dirección opuesta al codón. ^{[ 30 ] [ 29 ]}

Casi el 11% de todos los trastornos genéticos hereditarios son causados ​​por codones de parada prematuros (mutaciones sin sentido). Ejemplos notables de mutaciones sin sentido que han sido objeto de extensa investigación son el gen CFTR , que causa la fibrosis quística , y las mutaciones de la distrofina , que causan la distrofia muscular de Duchenne . La investigación terapéutica reciente se ha centrado en forzar la lectura completa de los codones de parada prematuros. Esto permitiría que la cadena de ARNm previamente mutada potencialmente codifique una proteína correctamente plegada. Un método común para forzar la lectura completa es limitar la actividad de eRF1 y eRF3. Un mecanismo propuesto consiste en limitar las concentraciones de eRF1 y eRF3 en las células, lo que teóricamente reduciría el reconocimiento del codón de parada. ^{[ 31 ]} Sin embargo, este mecanismo no se ha utilizado en tratamientos terapéuticos. En cambio, el mecanismo más prometedor implica la degradación química de eRF1 para lograr la lectura completa. Estos químicos pertenecen a la rama de fármacos denominados promotores de lectura completa. El mecanismo de los promotores de lectura completa varía, pero un mecanismo común es impedir que eRF1 se libere del ribosoma. Esto da como resultado un ribosoma detenido y, finalmente, una colisión con otro ribosoma. ^{[ 32 ]}

Una vez que eRF1 reconoce el codón de parada y se une al ribosoma, está listo para los pasos finales de la terminación: la hidrólisis del enlace peptídico. Para liberar el polipéptido del sitio p del ribosoma, se necesita una proteína adicional, una fuente de energía e iones que ayuden a eRF1, lo cual se logra mediante la formación de un complejo cuaternario. La proteína adicional es eRF3, que es una GTPasa ; la fuente de energía es una molécula de GTP y el ion es Mg²⁺ ^. Una vez que eRF3 se une a eRF1, su afinidad por el GTP aumenta significativamente en comparación con la afinidad de una proteína eRF3 sola. Cabe destacar que el reconocimiento del codón de parada no requiere GTP, mientras que la hidrólisis del peptidil-ARNt y la liberación del complejo de terminación sí lo requieren. ^{[ 33 ]}

Se han planteado numerosas hipótesis sobre la función de eRF3 en el complejo de terminación. Una hipótesis inicial sugería que eRF3 ayudaba a eRF1 a unirse al codón de parada, dado que eRF3 era estructuralmente similar a EF-TU , una GTPasa que transporta moléculas de ARNt cargadas al sitio aminoacilo del ribosoma en células procariotas . ^{[ 34 ] [ 35 ]} Otras hipótesis se centran en los efectos de la hidrólisis de GTP, mediada por eRF3, sobre eRF1. La configuración de GTP prehidrolizada del complejo de terminación favorece la unión de eRF1 al codón de parada y su orientación hacia el ARNt peptídico. La configuración de GDP posthidrolizada promueve la liberación del complejo y la disociación del ribosoma. ^{[ 36 ]}

Estudios adicionales plantean la hipótesis de que la hidrólisis de GTP debido a eRF3 permite que el sitio catalítico de eRF1 entre en el sitio p del ribosoma, promoviendo así la liberación del polipéptido naciente. ^{[ 33 ]}

El sitio catalítico responsable de la hidrólisis del peptidil-ARNt es el sitio GGQ en eRF1. El conocimiento actual sobre el sitio GGQ indica que este ingresa al sitio P del ribosoma, donde se encuentra el peptidil-ARNt, tras un cambio conformacional causado por la hidrólisis de GTP por eRF3. Además, cualquier mutación en el sitio GGQ inactiva eRF1, impidiendo así la terminación exitosa de la traducción. Esto se debe a que los dos residuos de glicina en GGQ adoptan un ángulo de torsión que solo es posible con dos glicinas. Sin el ángulo adecuado, el sitio activo de la reacción no puede funcionar correctamente. Para que la proteína naciente se libere, el sitio GGQ necesita reclutar una molécula de agua hacia el sitio activo de la reacción. El método de reclutamiento de una sola molécula de agua aún no se comprende completamente. Una vez en posición, la molécula de agua actúa como nucleófilo y ataca el grupo carbonilo del enlace éster entre la proteína naciente y el ARNt. La hidrólisis del enlace éster provoca la liberación de la proteína naciente y el desensamblaje del ribosoma y del complejo de terminación. ^{[ 37 ]}

La NMD no es la única vía de vigilancia del ARNm. La vía de degradación sin codón de parada (NGD) se utiliza para degradar las cadenas de ARNm que no tienen un codón de parada funcional. Este mecanismo utiliza dos proteínas, Dom34p y Hbs1p, que son muy similares a eRF1 y eRF3 respectivamente. Las proteínas Dom34p y Hbs1p reconocen los ribosomas detenidos para desencadenar la escisión endonucleolítica. ^{[ 45 ]} La degradación sin codón de parada (NSD) es otra vía que se ocupa de las cadenas de ARNm que no tienen un codón de parada funcional. Este mecanismo no incluye a eRF1, pero sí a la proteína Ski7p, homóloga de eRF3. Este mecanismo depende de la síntesis de una cola de poli-A, que detiene el ribosoma. El ribosoma detenido es entonces reconocido por Ski7p para su degradación. ^{[ 46 ] [ 47 ]}