Extracción diferencial

La extracción diferencial (también conocida como lisis diferencial) se refiere al proceso mediante el cual se puede extraer el ADN de dos tipos diferentes de células sin mezclar su contenido. La aplicación más común de este método es la extracción de ADN de células epiteliales vaginales y espermatozoides en casos de agresión sexual para determinar los perfiles de ADN de la víctima y el agresor. Su éxito se basa en que los espermatozoides empaquetan su ADN mediante protaminas (en lugar de histonas ), las cuales se mantienen unidas por enlaces disulfuro. Las protaminas secuestran el ADN de los espermatozoides, haciéndolo más resistente a la extracción que el ADN de las células epiteliales.

Tras determinar la presencia de espermatozoides (generalmente mediante tinción y microscopía óptica) en una muestra vaginal/rectal, las células epiteliales del sujeto se lisan mediante un método estándar de extracción de ADN, como la extracción con fenol/cloroformo , y su ADN se extrae por medios convencionales. El ADN epitelial de la solución se retira y se conserva, mientras que el ADN de los espermatozoides precipita con las protaminas unidas. La extracción diferencial utiliza un compuesto químico llamado ditiotreitol (DTT) para romper los enlaces de azufre de las protaminas y liberar así el ADN. Una vez que el ADN se separa de las protaminas, se puede extraer mediante métodos estándar. Esto genera dos fracciones de ADN diferentes a partir de una misma muestra: la de la víctima y la del agresor.

Sin embargo, el método descrito es difícil de llevar a cabo porque requiere mucho trabajo y tiempo, lo que genera una acumulación de kits de violación sin analizar. Se estima que solo en EE. UU. hay 500 000 kits de violación. ^{[ 1 ]} Greenspoon et al. ^{[ 2 ]} informaron mejoras en la eficiencia y el rendimiento del procesamiento de muestras mediante automatización robótica. Sin embargo, los costos asociados a la implementación, junto con las bajas cantidades de muestras procesadas, pueden resultar poco prácticos para los laboratorios forenses y no justificarse. ^{[ 3 ]}

Recientemente se introdujo un procedimiento de extracción de ácidos nucleicos en múltiples etapas para obtener lisados ​​de ADN de la más alta calidad. ^{[ 4 ]} Una membrana autosellante permite la liberación y separación gradual del ADN de muestras mixtas. Implementado en un sistema de columna de centrifugación , es ideal para procedimientos de extracción de ADN que implican la extracción diferencial de muestras forenses como epitelio, saliva o sangre frente a espermatozoides. Los protocolos de extracción simples y confiables para muestras teñidas y frotis ginecológicos, respectivamente, superan las dificultades frecuentemente mencionadas en la extracción diferencial (por ejemplo, la pérdida de un sedimento de espermatozoides durante varios pasos de lavado).

Además, gracias a la separación gradual del tampón, es posible tomar una decisión temprana y fundamentada sobre si el proceso de extracción diferencial justifica el tiempo y el esfuerzo invertidos. Asimismo, se puede realizar una prueba inmunológica preliminar para detectar semen en una muestra de agresión sexual utilizando la misma muestra.

En primer lugar, las proteínas humanas, por ejemplo el antígeno de semenogelina humana , pueden aislarse opcionalmente y analizarse inmunológicamente para comprobar rápidamente la presencia de líquido seminal humano. Si esta prueba muestra un resultado positivo, la misma muestra del caso se procesará posteriormente. ^{[ 5 ]} La primera parte de la lisis diferencial se lleva a cabo en condiciones suaves para obtener el ADN femenino. El lisado de las células epiteliales se retiene dentro de la columna incluso durante la incubación con calor y la agitación moderada. Tras la centrifugación, la solución pasa de la columna al tubo de recolección. El lisado de ADN se purifica posteriormente y se utiliza para generar un perfil STR autosómico de la víctima. Para obtener el ADN masculino que identificará al perpetrador, se aplicarán posteriormente condiciones de lisis más severas a la misma columna de filtro sin necesidad de transportar la muestra para romper los espermatozoides retenidos. Debido al alto rendimiento de ADN, la probabilidad de obtener un perfil de ADN exitoso mediante análisis posteriores aumenta significativamente. Este sencillo sistema permite ahorrar tiempo y aumentar la productividad en este proceso manual, lo que mejora los índices de resolución de delitos y acelera el análisis de las muestras de delitos acumuladas.