Decellularization

Decellularization (also spelled decellularisation in British English) is the process used in biomedical engineering to isolate the extracellular matrix (ECM) of a tissue from its inhabiting cells, leaving an ECM scaffold of the original tissue, which can be used in artificial organ and tissue regeneration. Organ and tissue transplantation treat a variety of medical problems, ranging from end organ failure to cosmetic surgery. One of the greatest limitations to organ transplantation derives from organ rejection caused by antibodies of the transplant recipient reacting to donorantigens on cell surfaces within the donor organ.^[1] Because of unfavorable immune responses, transplant patients suffer a lifetime taking immunosuppressing medication. Stephen F. Badylak pioneered the process of decellularization at the McGowan Institute for Regenerative Medicine at the University of Pittsburgh.^[2] This process creates a natural biomaterial to act as a scaffold for cell growth, differentiation and tissue development. By recellularizing an ECM scaffold with a patient's own cells, the adverse immune response is eliminated. Nowadays, commercially available ECM scaffolds are available for a wide variety of tissue engineering. Using peracetic acid to decellularize ECM scaffolds have been found to be false and only disinfects the tissue.

Con una amplia variedad de tratamientos inductores de descelularización disponibles, las combinaciones de tratamientos físicos, químicos y enzimáticos se monitorean cuidadosamente para asegurar que el andamio de ECM mantenga la integridad estructural y química del tejido original. ^{[ 2 ]} Los científicos pueden usar el andamio de ECM adquirido para reproducir un órgano funcional mediante la introducción de células progenitoras , o células madre adultas (ASC), y permitiendo que se diferencien dentro del andamio para desarrollarse en el tejido deseado. El órgano o tejido producido puede trasplantarse a un paciente. A diferencia de los anticuerpos de superficie celular, los componentes bioquímicos de la ECM se conservan entre huéspedes, por lo que el riesgo de una respuesta inmune hostil se minimiza. ^{[ 3 ] [ 4 ]} La conservación adecuada de las fibras de ECM, los factores de crecimiento y otras proteínas es imperativa para que las células progenitoras se diferencien en las células adultas adecuadas. El éxito de la descelularización varía según los componentes y la densidad del tejido aplicado y su origen. ^{[ 5 ]} Las aplicaciones del método de descelularización para la producción de un andamio de biomaterial para la regeneración de tejidos se encuentran en tejidos cardíacos , dérmicos , pulmonares , renales y de otros tipos. La reconstrucción completa de órganos aún se encuentra en las primeras etapas de desarrollo. ^{[ 6 ]}

Los investigadores pueden extraer tejido de un donante o cadáver , lisar y eliminar las células dentro del tejido sin dañar los componentes extracelulares, y obtener un producto que es el andamiaje de ECM natural que posee las mismas funciones físicas y bioquímicas del tejido natural. ^{[ 2 ]} Después de obtener el andamiaje de ECM, los científicos pueden recelularizar el tejido con células madre o progenitoras potentes que se diferenciarán en el tipo de tejido original. Al extraer las células de un tejido donante, se eliminan los anticuerpos inmunogénicos del donante. Las células progenitoras pueden obtenerse del huésped, por lo que no tendrán una respuesta adversa al tejido. Este proceso de descelularización de tejidos y órganos aún está en desarrollo, pero el proceso exacto de extraer un tejido de un donante y eliminar todos los componentes celulares se considera el proceso de descelularización. Los pasos para pasar de un andamiaje de ECM descelularizado a un órgano funcional se engloban dentro del concepto de recelularización. Debido a las diversas aplicaciones del tejido en el cuerpo humano, las técnicas de descelularización deben adaptarse al tejido específico en el que se trabaja. Los métodos de descelularización investigados incluyen tratamientos físicos, químicos y enzimáticos. Si bien algunos métodos son más comunes, la combinación exacta de tratamientos varía según el origen del tejido y su finalidad. ^{[ 5 ]}

En cuanto a la introducción de diferentes sustancias químicas y enzimas líquidas en un órgano o tejido, se han utilizado técnicas de descelularización por perfusión e inmersión. La descelularización por perfusión es aplicable cuando existe un extenso sistema vascular en el órgano o tejido. Es crucial que el andamiaje de la matriz extracelular (MEC) se descelularice en todos los niveles y de manera uniforme en toda la estructura. ^{[ 7 ] [ 8 ]} Debido a este requisito, los tejidos vascularizados pueden recibir sustancias químicas y enzimas mediante perfusión a través de las arterias, venas y capilares presentes. Bajo este mecanismo y en condiciones fisiológicas adecuadas, los tratamientos pueden difundirse de manera uniforme a todas las células dentro del órgano. Los tratamientos pueden eliminarse a través de las venas al final del proceso. La descelularización cardíaca y pulmonar a menudo utiliza este proceso para introducir los tratamientos debido a sus redes altamente vascularizadas. La descelularización por inmersión se logra mediante la inmersión de un tejido en tratamientos químicos y enzimáticos. Este proceso es más fácil de realizar que la perfusión , pero está limitado a tejidos delgados con un sistema vascular limitado.

Los métodos físicos más comunes para lisar, matar y eliminar células de la matriz de un tejido se emplean mediante temperatura, fuerza, presión y disrupción eléctrica. Los métodos de temperatura suelen utilizarse en un mecanismo rápido de congelación-descongelación. Al congelar rápidamente un tejido, se forman cristales de hielo microscópicos alrededor de la membrana plasmática y la célula se lisa. ^{[ 9 ]} Tras la lisis celular, el tejido puede exponerse a sustancias químicas líquidas que degradan y eliminan los componentes indeseables. Los métodos de temperatura conservan la estructura física del andamiaje de la matriz extracelular (MEC), pero se manejan mejor en tejidos gruesos y resistentes. ^{[ 10 ]}

La aplicación directa de presión a un tejido garantiza la ruptura de la estructura de la matriz extracelular (MEC), por lo que la presión se utiliza comúnmente. La descelularización por presión implica el uso controlado de presión hidrostática aplicada a un tejido u órgano. Esto se realiza mejor a altas temperaturas para evitar la formación incontrolada de cristales de hielo que podrían dañar el andamio. La ruptura eléctrica de la membrana plasmática es otra opción para lisar las células alojadas en un tejido u órgano. Al exponer un tejido a pulsos eléctricos, se forman microporos en la membrana plasmática. Las células finalmente mueren después de que su equilibrio eléctrico homeostático se ve alterado por el estímulo aplicado. Este proceso eléctrico se documenta como electroporación irreversible no térmica (NTIRE) y está limitado a tejidos pequeños y a las posibilidades limitadas de inducir una corriente eléctrica in vivo . ^{[ 2 ]}

La combinación adecuada de productos químicos para la descelularización se selecciona en función del grosor, la composición de la matriz extracelular y el uso previsto del tejido u órgano. Por ejemplo, las enzimas no se utilizan en tejidos colagenosos porque dañan las fibras del tejido conectivo. Sin embargo, cuando el colágeno no está presente en alta concentración o no es necesario en el tejido, las enzimas pueden ser una opción viable para la descelularización. Los productos químicos utilizados para eliminar las células incluyen ácidos, tratamientos alcalinos, detergentes iónicos , detergentes no iónicos y detergentes zwitteriónicos .

El detergente iónico dodecilsulfato de sodio (SDS) se usa comúnmente debido a su alta eficacia para lisar células sin dañar significativamente la matriz extracelular (MEC). ^{[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]} Los detergentes actúan eficazmente para lisar la membrana celular y exponer su contenido a una mayor degradación. Después de que el SDS lisa la membrana celular, las endonucleasas y exonucleasas degradan el contenido genético, mientras que otros componentes de la célula se solubilizan y se eliminan de la matriz. El SDS se usa comúnmente a pesar de que tiende a alterar ligeramente la estructura de la MEC. Los tratamientos alcalinos y ácidos pueden ser complementos eficaces para un tratamiento con SDS debido a su capacidad para degradar ácidos nucleicos y solubilizar inclusiones citoplasmáticas . ^{[ 5 ]}

El detergente no iónico más conocido es el Triton X-100 , popular por su capacidad para interrumpir las interacciones lípido-lípido y lípido -proteína. El Triton X-100 no interrumpe las interacciones proteína-proteína, lo cual es beneficioso para mantener intacta la matriz extracelular (MEC). El EDTA es un agente quelante que se une al calcio , un componente necesario para la interacción entre proteínas. Al impedir la disponibilidad de calcio, el EDTA evita que las proteínas integrales entre las células se unan. El EDTA se suele utilizar con tripsina, una enzima que actúa como proteasa para romper los enlaces existentes entre las proteínas integrales de células vecinas dentro de un tejido. La combinación de EDTA y tripsina resulta eficaz para la descelularización de tejidos.

Las enzimas utilizadas en los tratamientos de descelularización se emplean para romper los enlaces e interacciones entre los ácidos nucleicos, las células que interactúan a través de proteínas vecinas y otros componentes celulares. Se han utilizado lipasas , termolisina , galactosidasa , nucleasas y tripsina en la eliminación de células. Después de que una célula se lisa con un detergente, ácido, presión física, etc., las endonucleasas y exonucleasas pueden comenzar la degradación del material genético. Las endonucleasas cortan el ADN y el ARN en medio de las secuencias. La benzoasa, una endonucleasa, produce múltiples fragmentos nucleares pequeños que pueden degradarse aún más y eliminarse del andamiaje de la matriz extracelular. ^{[ 14 ]} Las exonucleasas actúan en el extremo de las secuencias de ADN para cortar los enlaces fosfodiéster y degradar aún más las secuencias de ácidos nucleicos.

Las enzimas como la tripsina actúan como proteasas que rompen las interacciones entre proteínas. Si bien la tripsina puede tener efectos adversos sobre las fibras de colágeno y elastina de la matriz extracelular (MEC), su uso controlado permite evitar cualquier daño potencial a dichas fibras. La dispasa se utiliza para prevenir la agregación celular no deseada, lo cual favorece su separación de la matriz extracelular. La experimentación ha demostrado que la dispasa es más eficaz en la superficie de tejidos delgados, como el pulmón, durante la regeneración del tejido pulmonar. Para eliminar con éxito las células profundas de un tejido mediante dispasa, a menudo se incluye agitación mecánica en el proceso.

La colagenasa se utiliza únicamente cuando el producto de andamiaje de matriz extracelular no requiere una estructura de colágeno intacta. Las lipasas se utilizan comúnmente cuando se necesitan injertos de piel descelularizados. Los ácidos lipasa actúan descelularizando los tejidos dérmicos mediante la deslipidación y la ruptura de las interacciones entre células altamente lipídicas. La enzima α-galactosidasa es un tratamiento relevante para eliminar el antígeno del epítopo Gal de las superficies celulares. ^{[ 5 ]}

Un andamio de ECM natural proporciona el entorno físico y bioquímico necesario para facilitar el crecimiento y la especialización de células madre y progenitoras potentes. Se han aislado matrices acelulares in vitro e in vivo en diversos tejidos y órganos. ^{[ 6 ]} La ECM descelularizada puede utilizarse para preparar biotinta para bioimpresión 3D. ^{[ 15 ]} El mayor éxito de los tejidos descelularizados se ha obtenido en tejidos simétricos con menor especialización, como injertos óseos y dérmicos; sin embargo, la investigación y los avances continúan a nivel de órganos.

Las matrices dérmicas acelulares han tenido éxito en diversas aplicaciones. Por ejemplo, los injertos de piel se utilizan en cirugía estética y en el tratamiento de quemaduras. El injerto de piel descelularizado proporciona soporte mecánico a la zona dañada, a la vez que favorece el desarrollo de tejido conectivo derivado del huésped. El tejido cardíaco ha demostrado ser clínicamente eficaz en el desarrollo de válvulas humanas a partir de matrices de ECM naturales. ^{[ 16 ]} Una técnica conocida como procedimiento de Ross utiliza una válvula cardíaca acelular para reemplazar una válvula defectuosa, permitiendo que las células nativas repueblen una válvula recién funcional. Los aloinjertos descelularizados han sido fundamentales en los injertos óseos que se utilizan en la reconstrucción ósea y en el reemplazo de huesos deformados en pacientes.

Las limitaciones de la ingeniería de tejido miocárdico radican en la capacidad de perfundir e implantar inmediatamente un corazón en un paciente. Si bien el andamiaje de la matriz extracelular (MEC) conserva las proteínas y los factores de crecimiento del tejido natural, la especialización a nivel molecular aún no ha sido aprovechada por los investigadores que utilizan andamiajes cardíacos descelularizados. Se ha obtenido un mayor éxito en el uso de órganos completos obtenidos mediante técnicas de descelularización en la investigación pulmonar. Los científicos han logrado regenerar pulmones completos in vitro a partir de pulmones de rata mediante perfusión-descelularización. Al sembrar la matriz con células pulmonares fetales de rata, se produjo un pulmón funcional. El pulmón producido in vitro se implantó con éxito en una rata, lo que demuestra las posibilidades de trasladar un órgano producido in vitro a un paciente.

Se han encontrado otros éxitos para la descelularización en la submucosa del intestino delgado (SIS), la ingeniería renal, hepática ^{[ 17 ] y pancreática. [ 18 ]} Debido a que es un material delgado, la matriz de SIS se puede descelularizar sumergiendo el tejido en tratamientos químicos y enzimáticos. La ingeniería de tejido renal aún está en desarrollo, pero las matrices de riñón cadavérico han podido sustentar el desarrollo de células renales fetales potentes. La ingeniería pancreática es un testimonio de la especificidad molecular de los órganos. Los científicos aún no han podido producir un páncreas completamente funcional , pero han tenido éxito en producir un órgano que funciona en segmentos específicos. Por ejemplo, se demostró que la diabetes en ratas disminuía al sembrar una matriz pancreática en sitios específicos. ^{[ 6 ]} Las futuras aplicaciones de la matriz de tejido descelularizado aún se están descubriendo y se considera una de las áreas más prometedoras en la investigación regenerativa.

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