teoría de la secuenciación del ADN

Todos los métodos convencionales de secuenciación de ADN se basan en la lectura de pequeños fragmentos de ADN y la posterior reconstrucción de estos datos para inferir el objetivo de ADN original, ya sea mediante ensamblaje o alineación con una referencia. La abstracción común a estos métodos es la de un problema de cobertura matemática . ^{[ 2 ]} Por ejemplo, se puede imaginar un segmento de línea que representa el objetivo y un proceso posterior en el que se "dejan caer" segmentos más pequeños en ubicaciones aleatorias del objetivo. El objetivo se considera "secuenciado" cuando se acumula una cobertura adecuada (por ejemplo, cuando no quedan huecos).

Las propiedades abstractas del recubrimiento han sido estudiadas por matemáticos durante más de un siglo. ^{[ 3 ]} Sin embargo, la aplicación directa de estos resultados no ha sido generalmente posible. Las soluciones matemáticas de forma cerrada, especialmente para distribuciones de probabilidad, a menudo no pueden evaluarse fácilmente. Es decir, implican cantidades excesivamente grandes de tiempo de computación para parámetros característicos de la secuenciación de ADN . La configuración de Stevens es un ejemplo de ello. ^{[ 4 ]} Los resultados obtenidos desde la perspectiva de las matemáticas puras tampoco tienen en cuenta factores que son realmente importantes en la secuenciación, por ejemplo, la superposición detectable en fragmentos de secuenciación, la doble hebra, los efectos de borde y la multiplicidad de objetivos. En consecuencia, el desarrollo de la teoría de la secuenciación ha procedido más de acuerdo con la filosofía de las matemáticas aplicadas . En particular, se ha centrado en el problema y hace un uso conveniente de aproximaciones, simulaciones, etc.

El primer resultado puede obtenerse directamente de la teoría elemental de la probabilidad . Supongamos que modelamos el proceso anterior tomando${\displaystyle L}$y${\displaystyle G}$como la longitud del fragmento y la longitud del objetivo, respectivamente. La probabilidad de "cubrir" cualquier ubicación dada en el objetivo con un fragmento en particular es entonces${\displaystyle L/G}$. (Esto presupone${\displaystyle L\ll G}$(lo cual es válido a menudo, pero no para todos los casos del mundo real). Por lo tanto, la probabilidad de que un solo fragmento no cubra una ubicación determinada en el objetivo es:${\displaystyle 1-L/G}$, y${\displaystyle \left[1-L/G\right]^{N}}$para${\displaystyle N}$fragmentos. Por lo tanto, la probabilidad de cubrir una ubicación determinada en el objetivo con al menos un fragmento es

${\displaystyle P=1-\left[1-{\frac {L}{G}}\right]^{N}.}$

Esta ecuación se utilizó por primera vez para caracterizar bibliotecas de plásmidos , ^{[ 5 ]} pero puede aparecer en una forma modificada. Para la mayoría de los proyectos${\displaystyle N\gg 1}$, de modo que, con un buen grado de aproximación

${\displaystyle \left[1-{\frac {L}{G}}\right]^{N}\sim \exp(-NL/G),}$

dónde${\displaystyle R=NL/G}$Se denomina redundancia . Nótese la importancia de la redundancia como representación del número promedio de veces que una posición está cubierta con fragmentos. Nótese también que, al considerar el proceso de cobertura sobre todas las posiciones en el objetivo, esta probabilidad es idéntica al valor esperado de la variable aleatoria.${\displaystyle C}$, la fracción de la cobertura objetivo. El resultado final,

${\displaystyle E\langle C\rangle =1-e^{-R},}$

Sigue utilizándose ampliamente como un estimador " aproximado " y predice que la cobertura para todos los proyectos evoluciona a lo largo de una curva universal que es función únicamente de la redundancia.

En 1988, Eric Lander y Michael Waterman publicaron un importante artículo ^{[ 6 ]} que examinaba el problema de la cobertura desde la perspectiva de los huecos. Si bien se centraron en el llamado problema de mapeo , la abstracción a la secuenciación es prácticamente la misma. Proporcionaron una serie de resultados útiles que se adoptaron como teoría estándar desde los inicios de la secuenciación genómica a gran escala. ^{[ 7 ]} Su modelo también se utilizó en el diseño del Proyecto Genoma Humano y sigue desempeñando un papel importante en la secuenciación del ADN.

En última instancia, el objetivo principal de un proyecto de secuenciación es cerrar todas las brechas, por lo que la "perspectiva de brechas" fue una base lógica para desarrollar un modelo de secuenciación. Uno de los resultados más utilizados de este modelo es el número esperado de contigs , dado el número de fragmentos secuenciados. Si se ignora la cantidad de secuencia que esencialmente se "desperdicia" al tener que detectar solapamientos, su teoría produce

${\displaystyle E\langle contigs\rangle =Ne^{-R}.}$

En 1995, Roach ^{[ 8 ]} publicó mejoras a esta teoría, lo que permitió aplicarla a proyectos de secuenciación cuyo objetivo era secuenciar completamente un genoma objetivo. Michael Wendl y Bob Waterston ^{[ 9 ]} confirmaron, basándose en el método de Stevens ^{[ 4 ]} , que ambos modelos producían resultados similares cuando el número de contigs era sustancial, como en proyectos de mapeo o secuenciación de baja cobertura. A medida que los proyectos de secuenciación se intensificaron en la década de 1990 y se acercaban a su finalización, las aproximaciones de baja cobertura resultaron insuficientes y se hizo necesario el modelo exacto de Roach. Sin embargo, a medida que disminuyó el coste de la secuenciación, los parámetros de los proyectos de secuenciación se volvieron más fáciles de probar empíricamente de forma directa, y el interés y la financiación para la genómica estratégica disminuyeron.

Las ideas básicas de la teoría de Lander-Waterman dieron lugar a varios resultados adicionales para variaciones particulares en las técnicas de mapeo. ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]} Sin embargo, los avances tecnológicos han vuelto obsoletas en gran medida las teorías de mapeo, excepto en organismos distintos de los organismos modelo altamente estudiados (por ejemplo, levaduras, moscas, ratones y humanos).

La estrategia de secuenciación se asemeja al proceso de estacionar autos a lo largo de un bordillo. Cada auto es un clon secuenciado y el bordillo es el objetivo genómico. ^{[ 13 ]} Cada clon secuenciado se examina para asegurar que los clones secuenciados posteriormente no se solapen con ningún clon secuenciado previamente. En esta estrategia, ningún esfuerzo de secuenciación es redundante. Sin embargo, al igual que los espacios entre autos estacionados, se acumulan espacios sin secuenciar, menores que la longitud de un clon, entre los clones secuenciados. Cerrar estos espacios puede tener un costo considerable.

En 1995, Roach et al. ^{[ 14 ]} propusieron y demostraron mediante simulaciones una generalización de un conjunto de estrategias exploradas previamente por Edwards y Caskey. ^{[ 15 ]} Este método de secuenciación del genoma completo se popularizó enormemente gracias al impulso de Celera , que lo utilizó para secuenciar diversos organismos modelo antes de aplicarlo al genoma humano. Actualmente, la mayoría de los proyectos de secuenciación emplean esta estrategia, a menudo denominada secuenciación de extremos apareados.

Los biólogos han desarrollado métodos para filtrar regiones altamente repetitivas, esencialmente no secuenciables, de los genomas. Estos procedimientos son importantes para organismos cuyos genomas consisten principalmente en dicho ADN, por ejemplo, el maíz. Producen multitud de pequeñas islas de productos de ADN secuenciables. Wendl y Barbazuk ^{[ 16 ]} propusieron una extensión de la teoría de Lander-Waterman para explicar las "brechas" en el objetivo debido al filtrado y al llamado "efecto de borde". Este último es un sesgo de muestreo específico de la posición, por ejemplo, la posición de la base terminal tiene solo una${\displaystyle 1/G}$posibilidad de estar cubierto, en contraposición a${\displaystyle L/G}$para puestos interiores. Para${\displaystyle R<1}$La teoría clásica de Lander-Waterman sigue ofreciendo buenas predicciones, pero la dinámica cambia para mayores redundancias.

Los métodos de secuenciación modernos suelen secuenciar ambos extremos de un fragmento más grande, lo que proporciona información de enlace para el ensamblaje de novo y mayores probabilidades de alineación con la secuencia de referencia. Los investigadores generalmente creen que longitudes de datos más largas (longitudes de lectura) mejoran el rendimiento para objetivos de ADN muy grandes, una idea consistente con las predicciones de los modelos de distribución. ^{[ 17 ]} Sin embargo, Wendl ^{[ 18 ]} demostró que los fragmentos más pequeños proporcionan una mejor cobertura en objetivos pequeños y lineales porque reducen el efecto de borde en las moléculas lineales. Estos hallazgos tienen implicaciones para la secuenciación de los productos de los procedimientos de filtrado de ADN. El emparejamiento de lecturas y el tamaño del fragmento evidentemente tienen una influencia insignificante para objetivos grandes de clase de genoma completo.

La secuenciación está emergiendo como una herramienta importante en medicina, por ejemplo en la investigación del cáncer. En este ámbito, la capacidad de detectar mutaciones heterocigotas es crucial ^, y esto solo es posible si se obtiene la secuencia del genoma diploide . En los esfuerzos pioneros para secuenciar individuos, Levy et al. ^{[ 19 ]} y Wheeler et al. [ ^{20 ]} , quienes secuenciaron a Craig Venter y Jim Watson , respectivamente, describieron modelos para cubrir ambos alelos en un genoma. Wendl y Wilson ^{[ 21 ]} continuaron con una teoría más general que permitía un número arbitrario de coberturas de cada alelo y una ploidía arbitraria . Estos resultados apuntan a la conclusión general de que la cantidad de datos necesarios para tales proyectos es significativamente mayor que para los proyectos haploides tradicionales. Generalmente, una redundancia de al menos 30 veces, es decir, que cada nucleótido esté cubierto por un promedio de 30 lecturas de secuencia, es ahora el estándar. ^{[ 22 ]} Sin embargo, los requisitos pueden ser aún mayores, dependiendo de qué tipo de eventos genómicos se busquen. Por ejemplo, en el llamado "método de pares de lecturas discordantes", se pueden inferir inserciones de ADN si la distancia entre pares de lecturas es mayor de lo esperado. Los cálculos muestran que se necesita una redundancia de aproximadamente 50 veces para evitar errores de falsos positivos con un umbral del 1 %. ^{[ 23 ]}

La llegada de la secuenciación de próxima generación también ha hecho posible la secuenciación de poblaciones a gran escala, por ejemplo, el Proyecto 1000 Genomas para caracterizar la variación en grupos de población humana. Si bien la variación común se captura fácilmente, la variación rara plantea un desafío de diseño: muy pocas muestras con redundancia de secuencia significativa corren el riesgo de no tener una variante en el grupo de muestra, pero muestras grandes con poca redundancia corren el riesgo de no capturar una variante en el conjunto de lecturas que realmente está en el grupo de muestra. Wendl y Wilson ^{[ 24 ]} informan un conjunto simple de reglas de optimización que maximizan la probabilidad de descubrimiento para un conjunto dado de parámetros. Por ejemplo, para observar un alelo raro al menos dos veces (para eliminar la posibilidad de que sea único para un individuo) se debe usar una redundancia un poco menor a 4 veces, independientemente del tamaño de la muestra.

Los instrumentos de nueva generación ahora también permiten la secuenciación de comunidades metagenómicas completas no cultivadas. El escenario de secuenciación es más complejo en este caso y existen diversas maneras de plantear teorías de diseño para un proyecto dado. Por ejemplo, Stanhope ^{[ 25 ]} desarrolló un modelo probabilístico para la cantidad de secuencia necesaria para obtener al menos un contig de un tamaño dado de cada organismo nuevo de la comunidad, mientras que Wendl et al. informaron un análisis para el tamaño promedio del contig o la probabilidad de recuperar completamente un organismo nuevo para una rareza dada dentro de la comunidad. ^{[ 26 ]} Por el contrario, Hooper et al. proponen un modelo semiempírico basado en la distribución gamma . ^{[ 27 ]}