Hemocitómetro

El hemocitómetro (o cámara de Burker) es un dispositivo de cámara de recuento diseñado originalmente y utilizado habitualmente para contar células sanguíneas . ^{[ 1 ]}

El hemocitómetro fue inventado por Louis-Charles Malassez y consiste en una lámina de vidrio gruesa para microscopio con una hendidura rectangular que crea una cámara de volumen de precisión. Esta cámara está grabada con una cuadrícula de líneas perpendiculares grabada con láser. El dispositivo está diseñado cuidadosamente para que se conozca el área delimitada por las líneas y también la profundidad de la cámara. Al observar un área definida de la cuadrícula, es posible contar el número de células o partículas en un volumen específico de fluido y, por lo tanto, calcular la concentración total de células en el fluido. Un tipo de hemocitómetro muy utilizado es la cámara de recuento de Neubauer . ^{[ 2 ]}

Otros tipos de hemocitómetros con diferentes cuadrículas se utilizan para distintas aplicaciones. Las cuadrículas de Fuchs-Rosenthal se utilizan comúnmente para el recuento de líquido cefalorraquídeo; las cuadrículas de Howard para moho se utilizan para el moho en alimentos y productos de envasado de alimentos ; la cuadrícula de McMaster para portaobjetos de huevos se utiliza para el recuento de huevos microbianos en material fecal; la cuadrícula de Nageotte para cámaras se utiliza para el recuento de bajos niveles de leucocitos en componentes plaquetarios reducidos; y la cuadrícula de Palmer para nanoplancton se utiliza para el recuento de plancton más pequeño. El contador de Petroff-Hausser, que utiliza cuadrículas de Neubauer mejoradas, se utiliza para el recuento de bacterias o espermatozoides y se ofrece con diferentes profundidades de cámara. La cuadrícula de Sedgwick-Rafter para células en un hemocitómetro está diseñada principalmente para su uso en la microscopía de agua potable.

El área cuadriculada del hemocitómetro de Neubauer mejorado consta de nueve cuadrados de 1 x 1  mm (1  mm² ⁾ . Estos se subdividen en tres direcciones: 0,25 x 0,25  mm (0,0625  mm² ⁾ , 0,25 x 0,20  mm (0,05 ^mm²  ) y 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm² ⁾ . El cuadrado central se subdivide a su vez en cuadrados de 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm² ⁾ . Los bordes elevados del hemocitómetro mantienen el cubreobjetos a 0,1 mm de la cuadrícula marcada, lo que confiere a cada cuadrado un volumen definido (véase la figura de la derecha). ^{[ 3 ]}     

Para utilizar el hemocitómetro, asegúrese primero de que el cubreobjetos especial provisto con la cámara de recuento esté correctamente colocado sobre la superficie de la cámara. Cuando las dos superficies de vidrio estén en contacto adecuado, se podrán observar los anillos de Newton . Si es así, la suspensión celular se aplica al borde del cubreobjetos para que sea absorbida por capilaridad , llenando completamente la cámara con la muestra. El número de células en la cámara se puede determinar mediante recuento directo con un microscopio , y las células visualmente distinguibles se pueden contar diferencialmente. El número de células en la cámara se utiliza para calcular la concentración o densidad de las células en la mezcla de la que proviene la muestra. Se calcula dividiendo el número de células en la cámara entre el volumen de la cámara, que se conoce desde el principio, teniendo en cuenta cualquier dilución y atajo de recuento.

${\displaystyle {\mbox{concentración de células en la mezcla original}}=\left({\frac {\mbox{número de células contadas}}{({\mbox{proporción de la cámara contada}})({\mbox{volumen de los cuadrados contados}})}}\right)\left({\frac {\mbox{volumen de la muestra diluida}}{\mbox{volumen de la mezcla original en la muestra}}}\right)}$^{[ 4 ]}

${\displaystyle {\mbox{células/mL}}=\left({\frac {({\mbox{número de células contadas}})({\mbox{factor de dilución}})}{({\mbox{número de cuadrados grandes contados}})}}\right)\times 10000}$

donde el volumen de la muestra diluida (después de la dilución) dividido por el volumen de la mezcla original en la muestra (antes de la dilución) es el factor de dilución . Por ejemplo, si el volumen de la mezcla original era de 20 μL y se diluyó una vez (añadiendo 20 μL de diluyente), entonces el segundo término entre paréntesis es 40 μL/20 μL. El volumen de los cuadrados contados es el que se muestra en la tabla de arriba, dependiendo del tamaño (ver figura de la derecha). El número de células contadas es la suma de todas las células contadas en los cuadrados de una cámara. La proporción de las células contadas se aplica si no se cuentan todos los cuadrados internos dentro de un cuadrado determinado (es decir, si solo se cuentan 4 de los 20 en un cuadrado de esquina, entonces este término será igual a 0,2). Cuando se cuentan cuadrados grandes con un volumen de 100 nanolitros (nL), una multiplicación por 10000 da como resultado el recuento de células deseado por mililitro.

Para la mayoría de las aplicaciones, solo se utilizan los cuatro cuadrados grandes de las esquinas. Se cuentan las celdas que están sobre o tocan las líneas superior e izquierda, pero se ignoran las que están sobre o tocan las líneas derecha o inferior. ^{[ 5 ]}

La suspensión original debe mezclarse completamente antes de tomar una muestra. Esto garantiza que la muestra sea representativa y no simplemente un artefacto de la región específica de la mezcla original de la que se extrajo.

Debe utilizarse una dilución adecuada de la mezcla en función del número de células que se van a contar. Si la muestra no está suficientemente diluida, las células estarán demasiado juntas y será difícil contarlas. Si está demasiado diluida, el tamaño de la muestra no será suficiente para obtener conclusiones fiables sobre la concentración en la mezcla original.

Al realizar una prueba redundante en una segunda cámara, se pueden comparar los resultados. Si difieren en más de 2 veces el error de conteo (raíz cuadrada del conteo, ^{[ 6 ]} mediante el modelado de las células como un proceso puntual de Poisson ), el método de toma de la muestra puede no ser fiable (por ejemplo, la mezcla original no está bien mezclada).

La cámara de recuento debe llenarse por capilaridad una vez colocada la tapa (un cubreobjetos especial con grosor y planitud certificados). Esto evita que las células se sedimenten o se adhieran al vidrio, o que parte del volumen se evapore antes de colocar el cubreobjetos, lo que podría resultar en una sobreestimación de la concentración celular. La sedimentación es menos problemática con las bacterias, pero la evaporación, más frecuente en laboratorios climatizados con baja humedad, debe minimizarse.

• Recuentos sanguíneos : para pacientes con células sanguíneas anormales, en los que los contadores automatizados no funcionan correctamente.
• Recuento de espermatozoides
• Microscopía de orina
• Cultivo celular: cuando se realiza un subcultivo o se registra el crecimiento celular a lo largo del tiempo.
• Elaboración de cerveza : para la preparación de la levadura.
• Recuento de células de fitoplancton
• Procesamiento celular para análisis posteriores: en muchas pruebas ( PCR , citometría de flujo ) se necesita un recuento celular preciso , mientras que otras requieren una alta viabilidad celular.
• Medición del tamaño celular: en una micrografía, el tamaño celular real se puede inferir escalándolo al ancho de un cuadrado de hemocitómetro, que es conocido. ^{[ 7 ]}

• Retículo
• micrómetro ocular
• Contador de la Colonia de Quebec

• Ejercicio en línea archivado el 5 de junio de 2024 en Wayback Machine : recuento de levaduras en cámaras de recuento Neubauer mejoradas o Thoma.
• Calculadora de hemocitómetro online
• Tipos de hemocitómetros