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Cromatografía de contracorriente

Un sistema de cromatografía en contracorriente de alto rendimiento La cromatografía en contracorriente ( CCC , también cromatografía de contracorriente ) es una forma de cromato...

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Un sistema de cromatografía en contracorriente de alto rendimiento

La cromatografía en contracorriente ( CCC , también cromatografía de contracorriente ) es una forma de cromatografía líquido-líquido que utiliza una fase estacionaria líquida que se mantiene en su lugar por la inercia de las moléculas que componen la fase estacionaria que se aceleran hacia el centro de una centrífuga debido a la fuerza centrípeta [1] y se utiliza para separar, identificar y cuantificar los componentes químicos de una mezcla . En su sentido más amplio, la cromatografía en contracorriente abarca una colección de técnicas de cromatografía líquida relacionadas que emplean dos fases líquidas inmiscibles sin un soporte sólido. [1] [2] Las dos fases líquidas entran en contacto entre sí a medida que al menos una fase se bombea a través de una columna , un tubo hueco o una serie de cámaras conectadas con canales, que contiene ambas fases. La acción de mezcla y sedimentación dinámica resultante permite separar los componentes por sus respectivas solubilidades en las dos fases. Se puede emplear una amplia variedad de sistemas de disolventes de dos fases que constan de al menos dos líquidos inmiscibles para proporcionar la selectividad adecuada para la separación deseada. [3] [4]

Algunos tipos de cromatografía en contracorriente, como la CCC de flujo dual, presentan un verdadero proceso de contracorriente donde las dos fases inmiscibles fluyen una sobre la otra y salen en extremos opuestos de la columna. [5] Sin embargo, con mayor frecuencia, un líquido actúa como fase estacionaria y se retiene en la columna mientras se bombea la fase móvil a través de ella. La fase estacionaria líquida se mantiene en su lugar por gravedad o inercia de las moléculas que componen la fase estacionaria que aceleran hacia el centro de una centrífuga debido a la fuerza centrípeta . Un ejemplo de un método de gravedad se llama cromatografía en contracorriente de gotas (DCCC). [6] Hay dos modos por los cuales la fase estacionaria es retenida por la fuerza centrípeta: hidrostático e hidrodinámico . En el método hidrostático, la columna gira alrededor de un eje central. [7] Los instrumentos hidrostáticos se comercializan con el nombre de cromatografía de partición centrífuga (CPC). [8] Los instrumentos hidrodinámicos a menudo se comercializan como instrumentos de cromatografía en contracorriente de alta velocidad o alto rendimiento (HSCCC y HPCCC respectivamente) que dependen de la fuerza del tornillo de Arquímedes en una bobina helicoidal para retener la fase estacionaria en la columna. [9]

Los componentes de un sistema CCC son similares a la mayoría de las configuraciones de cromatografía líquida, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Una o más bombas suministran las fases a la columna, que es el instrumento CCC en sí. Las muestras se introducen en la columna a través de un bucle de muestra lleno de una jeringa automática o manual. El flujo de salida se controla con varios detectores, como la espectroscopia ultravioleta-visible o la espectrometría de masas . El funcionamiento de las bombas, el instrumento CCC, la inyección de muestra y la detección se pueden controlar manualmente o con un microprocesador.

Historia

El predecesor de la teoría y la práctica de la cromatografía en contracorriente moderna fue la distribución en contracorriente (CCD). La teoría de la CCD fue descrita en la década de 1930 por Randall y Longtin. [10] Archer Martin y Richard Laurence Millington Synge desarrollaron aún más la metodología durante la década de 1940. [11] Finalmente, Lyman C. Craig introdujo el aparato de distribución en contracorriente Craig en 1944, que hizo que la CCD fuera práctica para el trabajo de laboratorio. [12] La CCD se utilizó para separar una amplia variedad de compuestos útiles durante varias décadas. [13]

Cromatografía líquida sin soporte

La cromatografía en columna estándar consta de una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida, mientras que la cromatografía de gases (GC) utiliza una fase estacionaria sólida o líquida sobre un soporte sólido y una fase móvil gaseosa. Por el contrario, en la cromatografía líquido-líquido, tanto la fase móvil como la estacionaria son líquidas. Sin embargo, el contraste no es tan marcado como parece a primera vista. En la cromatografía de fase inversa , por ejemplo, la fase estacionaria puede considerarse como un líquido que se inmoviliza mediante enlaces químicos a un soporte sólido de sílice microporoso . En la cromatografía en contracorriente, las fuerzas centrípetas o gravitacionales inmovilizan la capa líquida estacionaria. Al eliminar los soportes sólidos, se evita la adsorción permanente del analito en la columna y se puede lograr una alta recuperación del analito. [14] El instrumento de cromatografía en contracorriente se cambia fácilmente entre cromatografía de fase normal y cromatografía de fase inversa simplemente cambiando las fases móvil y estacionaria. En la cromatografía en columna, el potencial de separación está limitado por los medios de fase estacionaria disponibles comercialmente y sus características particulares. Casi cualquier par de soluciones inmiscibles se puede utilizar en la cromatografía en contracorriente, siempre que se pueda retener con éxito la fase estacionaria.

Los costos de los solventes también son generalmente más bajos que en la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). En comparación con la cromatografía en columna, los flujos y el uso total de solventes pueden reducirse a la mitad e incluso hasta una décima parte en la mayoría de las separaciones por cromatografía en contracorriente. [15] Además, se elimina el costo de compra y eliminación de los medios de fase estacionaria. Otra ventaja de la cromatografía en contracorriente es que los experimentos realizados en el laboratorio se pueden escalar a volúmenes industriales. Cuando la cromatografía de gases o la HPLC se realizan con grandes volúmenes, se pierde resolución debido a problemas con las relaciones superficie-volumen y la dinámica del flujo; esto se evita cuando ambas fases son líquidas. [16]

Coeficiente de partición (K D )

El proceso de separación CCC puede considerarse como si ocurriera en tres etapas: mezcla, sedimentación y separación de las dos fases (aunque a menudo ocurren de forma continua). La mezcla vigorosa de las fases es fundamental para maximizar el área interfacial entre ellas y mejorar la transferencia de masa . El analito se distribuirá entre las fases de acuerdo con su coeficiente de partición , que también se denomina coeficiente de distribución, constante de distribución o relación de partición y se representa por P, K, D, K c o K D. [17] El coeficiente de partición para un analito en un sistema de disolvente bifásico particular es independiente del volumen del instrumento, la velocidad de flujo, la relación de volumen de retención de fase estacionaria y la fuerza g requerida para inmovilizar la fase estacionaria . El grado de retención de fase estacionaria es un parámetro crucial. Los factores comunes que influyen en la retención de fase estacionaria son la velocidad de flujo, la composición del disolvente del sistema de disolvente bifásico y la fuerza g . La retención de fase estacionaria está representada por la relación de retención de volumen de fase estacionaria (Sf), que es el volumen de la fase estacionaria dividido por el volumen total del instrumento. El tiempo de sedimentación es una propiedad del sistema de solvente y de la matriz de la muestra , los cuales influyen en gran medida en la retención de la fase estacionaria. [18]

Para la mayoría de los químicos de procesos, el término "contracorriente" implica dos líquidos inmiscibles que se mueven en direcciones opuestas, como ocurre típicamente en las grandes unidades de extracción centrífuga . Con la excepción de la CCC de flujo dual (ver más abajo), la mayoría de los modos de operación de cromatografía en contracorriente tienen una fase estacionaria y una fase móvil. Incluso en esta situación, se producen flujos en contracorriente dentro de la columna del instrumento. [19] Varios investigadores han propuesto cambiar el nombre de CCC y CPC a cromatografía líquido-líquido, [20] pero otros creen que el término "contracorriente" en sí mismo es un nombre inapropiado. [21]

A diferencia de la cromatografía en columna y la HPLC, los operadores de cromatografía en contracorriente pueden inyectar grandes volúmenes en relación con el volumen de la columna. [22] Normalmente, se puede inyectar entre el 5 y el 10 % del volumen de la bobina. En algunos casos, esto se puede aumentar hasta el 15 o 20 % del volumen de la bobina. [23] Normalmente, la mayoría de los CCC y CPC comerciales modernos pueden inyectar una capacidad de entre 5 y 40 g/L. El rango es tan amplio, incluso para un instrumento específico, y mucho menos para todas las opciones de instrumentos, ya que el tipo de objetivo, la matriz y el disolvente bifásico disponible varían mucho. Aproximadamente 10 g/L sería un valor más típico, que la mayoría de las aplicaciones podrían utilizar como valor base.

La separación a contracorriente comienza con la elección de un sistema de disolvente bifásico adecuado para la separación deseada. El profesional de la CCC dispone de una amplia gama de mezclas de disolventes bifásicos, incluida la combinación de n-hexano (o heptano ), acetato de etilo , metanol y agua en diferentes proporciones. [24] Este sistema de disolvente básico a veces se denomina sistema de disolvente HEMWat. [ cita requerida ] La elección del sistema de disolvente puede guiarse por la lectura de la literatura de CCC. La técnica familiar de cromatografía de capa fina también puede emplearse para determinar un sistema de disolvente óptimo. [25] La organización de los sistemas de disolventes en "familias" también ha facilitado enormemente la elección de los sistemas de disolventes. [26] Un sistema de disolventes se puede probar con un experimento de partición en un matraz. El coeficiente de partición medido a partir del experimento de partición indicará el comportamiento de elución del compuesto. Por lo general, es deseable elegir un sistema de disolventes en el que el compuesto o compuestos objetivo tengan un coeficiente de partición entre 0,25 y 8. [27] Históricamente, se pensaba que ningún cromatógrafo de contracorriente comercial podría hacer frente a las altas viscosidades de los líquidos iónicos . Sin embargo, se han puesto a disposición instrumentos modernos que pueden admitir entre un 30 y un 70 % de líquidos iónicos (y potencialmente un 100 % de líquido iónico, si ambas fases son líquidos iónicos personalizados adecuadamente). [28] Los líquidos iónicos se pueden personalizar para compuestos orgánicos polares/no polares, aquirales y quirales , biomoléculas y separaciones inorgánicas, ya que los líquidos iónicos se pueden personalizar para tener una solvencia y especificidad extraordinarias. [29]

Una vez que se ha elegido el sistema de disolvente bifásico, se formula un lote de disolventes y se equilibra en un embudo de decantación . Este paso se denomina preequilibrio del sistema de disolventes. Se separan las dos fases. A continuación, se llena la columna con fase estacionaria con una bomba. A continuación, se establecen en la columna condiciones de equilibrio, como la velocidad de rotación deseada, y se bombea la fase móvil a través de la columna. La fase móvil desplaza una parte de la fase estacionaria hasta que se logra el equilibrio de la columna y la fase móvil se eluye de la columna. La muestra se puede introducir en la columna en cualquier momento durante el paso de equilibrio de la columna o después de que se haya logrado el equilibrio. Una vez que el volumen de eluyente supera el volumen de la fase móvil en la columna, los componentes de la muestra comenzarán a eluirse. Los compuestos con un coeficiente de partición de la unidad se eluirán cuando un volumen de columna de fase móvil haya pasado a través de la columna desde el momento de la inyección. A continuación, el compuesto se puede introducir en otra fase estacionaria para ayudar a aumentar la resolución de los resultados. [30] El flujo se detiene después de que se eluyen los compuestos objetivo o se extruye la columna bombeando la fase estacionaria a través de la columna. Un ejemplo de una aplicación importante de la cromatografía en contracorriente es tomar una matriz extremadamente compleja, como un extracto de planta, realizar la separación por cromatografía en contracorriente con un sistema de disolventes cuidadosamente seleccionado y extruir la columna para recuperar toda la muestra. La matriz compleja original se habrá fraccionado en bandas de polaridad estrechas discretas , que luego se pueden analizar para determinar su composición química o bioactividad. La realización de una o más separaciones por cromatografía en contracorriente junto con otras técnicas cromatográficas y no cromatográficas tiene el potencial de lograr avances rápidos en el reconocimiento de la composición de matrices extremadamente complejas. [31] [32]

Gota CCC

La cromatografía en contracorriente de gotas (DCCC) fue introducida en 1970 por Tanimura, Pisano, Ito y Bowman. [33] La DCCC utiliza únicamente la gravedad para mover la fase móvil a través de la fase estacionaria, que se encuentra en tubos verticales largos conectados en serie. En el modo descendente, las gotas de la fase móvil más densa y de la muestra pueden caer a través de las columnas de la fase estacionaria más ligera utilizando únicamente la gravedad. Si se utiliza una fase móvil menos densa, ascenderá a través de la fase estacionaria; esto se denomina modo ascendente. El eluyente de una columna se transfiere a otra; cuantas más columnas se utilicen, más platos teóricos se pueden lograr. La DCCC tuvo cierto éxito con las separaciones de productos naturales, pero fue eclipsada en gran medida por el rápido desarrollo de la cromatografía en contracorriente de alta velocidad. [34] La principal limitación de la DCCC es que los caudales son bajos y se logra una mezcla deficiente para la mayoría de los sistemas de disolventes binarios.

CCC hidrodinámico

La era moderna de la CCC comenzó con el desarrollo de la centrífuga planetaria por el Dr. Yoichiro Ito, que se introdujo por primera vez en 1966 como un tubo helicoidal cerrado que giraba sobre un eje "planetario" como gira sobre un eje "solar". [35] Posteriormente se desarrolló un modelo de flujo continuo y la nueva técnica se denominó cromatografía de contracorriente en 1970. [2] La técnica se desarrolló aún más empleando mezclas de prueba de aminoácidos DNP en un sistema de disolventes de cloroformo : ácido acético glacial : ácido clorhídrico acuoso 0,1 M (2:2:1 v/v). [36] Se necesitó mucho desarrollo para diseñar el instrumento de modo que se pudiera mantener el movimiento planetario requerido mientras se bombeaban las fases a través de la(s) bobina(s). [37] Se investigaron parámetros como la rotación relativa de los dos ejes (sincrónico o no sincrónico), la dirección del flujo a través de la bobina y los ángulos del rotor. [38] [39]

Alta velocidad

En 1982, la tecnología estaba lo suficientemente avanzada para que la técnica se llamara cromatografía de contracorriente de "alta velocidad" (HSCCC). [40] [41] Peter Carmeci comercializó inicialmente el separador/extractor de bobinas multicapa Ito de PC Inc. que utilizaba una sola bobina (sobre la que se enrolla la bobina) y un contrapeso, además de un conjunto de "conductores volantes" que son tubos que conectan las bobinas. [42] El Dr. Walter Conway y otros desarrollaron más tarde el diseño de la bobina de modo que se pudieran colocar múltiples bobinas, incluso bobinas de diferentes tamaños de tubos, en la bobina única. [43] Edward Chou desarrolló y comercializó más tarde un diseño de triple bobina como Pharmatech CCC que tenía un mecanismo de destorsión para los conductores entre las tres bobinas. [44] El Quattro CCC lanzado en 1993 desarrolló aún más los instrumentos disponibles comercialmente al utilizar un novedoso diseño de bobina doble con imagen especular que no necesitaba el mecanismo de destorsión del Pharmatech entre las múltiples bobinas, por lo que aún podía acomodar múltiples bobinas en el mismo instrumento. [45] Los CCC hidrodinámicos ahora están disponibles con hasta 4 bobinas por instrumento. Estas bobinas pueden ser de PTFE , PEEK , PVDF o tubos de acero inoxidable. Las 2, 3 o 4 bobinas pueden ser todas del mismo orificio para facilitar el CCC "2D" (ver a continuación). Las bobinas se pueden conectar en serie para alargar la bobina y aumentar la capacidad, o las bobinas se pueden vincular en paralelo para que se puedan realizar 2, 3 o 4 separaciones simultáneamente. Las bobinas también pueden ser de diferentes tamaños, en un instrumento, que van desde 1 a 6 mm en un instrumento, lo que permite que un solo instrumento optimice de mg a kilos por día. Más recientemente, se han ofrecido derivados de instrumentos con sellos giratorios para varios diseños CCC hidrodinámicos, en lugar de cables voladores, ya sea como opciones personalizadas o estándar. [46] [47] [48] [49] [50]

Alto rendimiento

El principio de funcionamiento de los equipos CCC requiere una columna que consiste en un tubo enrollado alrededor de una bobina. La bobina gira en un movimiento giratorio de doble eje ( cardioide ), lo que hace que una fuerza g variable actúe sobre la columna durante cada rotación. Este movimiento hace que la columna experimente un paso de partición por revolución y que los componentes de la muestra se separen en la columna debido a su coeficiente de partición entre las dos fases líquidas inmiscibles. La cromatografía en contracorriente de "alto rendimiento" (HPCCC) funciona de forma muy similar a la HSCCC. Un proceso de investigación y desarrollo de siete años produjo instrumentos HPCCC que generaban 240 g, en comparación con los 80 g de las máquinas HSCCC. Este aumento de la fuerza g y el mayor diámetro de la columna han permitido un aumento de diez veces en el rendimiento, debido a las mejores tasas de flujo de la fase móvil y una mayor retención de la fase estacionaria. [51] La cromatografía de contracorriente es una técnica de cromatografía líquida preparativa, sin embargo, con la llegada de los instrumentos HPCCC de mayor g, ahora es posible operar instrumentos con cargas de muestra tan bajas como unos pocos miligramos, mientras que en el pasado eran necesarios cientos de miligramos. Las principales áreas de aplicación para esta técnica incluyen la purificación de productos naturales y el desarrollo de fármacos. [52]

CCC hidrostático

La cromatografía de partición centrífuga (CPC) o CCC hidrostática fue inventada en la década de 1980 por la empresa japonesa Sanki Engineering Ltd, cuyo presidente era Kanichi Nunogaki. [8] [53] La CPC se ha desarrollado ampliamente en Francia a partir de finales de la década de 1990. En Francia, inicialmente optimizaron el concepto de disco apilado iniciado por Sanki. Más recientemente, en Francia y el Reino Unido, se han desarrollado configuraciones de CPC de disco no apilado con rotores de PTFE , acero inoxidable o titanio . Estos se han diseñado para superar posibles fugas entre los discos apilados del concepto original y para permitir la limpieza con vapor para una buena práctica de fabricación . Los volúmenes que van desde 100 ml a 12 litros están disponibles en diferentes materiales de rotor. El CPC de rotor de 25 litros tiene un rotor de titanio. [54] Esta técnica a veces se vende con el nombre de CPC "rápido" o CPC de "alto rendimiento".

Realización

El instrumento cromatógrafo de partición centrífuga está constituido por un rotor único que contiene la columna. Este rotor gira sobre su eje central (mientras que la columna HSCCC gira sobre su eje planetario y simultáneamente gira excéntricamente sobre otro eje solar). Con menos vibraciones y ruido, el CPC ofrece un rango típico de velocidad de rotación de 500 a 2000 rpm. A diferencia del CCC hidrodinámico, la velocidad de rotación no es directamente proporcional a la relación de volumen de retención de la fase estacionaria. Al igual que el DCCC, el CPC puede funcionar en modo descendente o ascendente, donde la dirección es relativa a la fuerza generada por el rotor en lugar de la gravedad. Una columna CPC rediseñada con cámaras y canales más grandes se ha denominado extracción por partición centrífuga (CPE). [55] En el diseño CPE, se pueden lograr velocidades de flujo más rápidas y una mayor carga de la columna.

Ventajas

Visualización de la mezcla y la sedimentación en una celda gemela CPC

El CPC permite escalar directamente desde aparatos analíticos (unos pocos mililitros) a aparatos industriales (varios litros) para una producción rápida por lotes. El CPC parece ser particularmente adecuado para acomodar sistemas de solventes bifásicos acuosos. [56] Generalmente, los instrumentos de CPC pueden retener sistemas de solventes que no se retienen bien en un instrumento hidrodinámico debido a pequeñas diferencias de densidad entre las fases. [57] Ha sido muy útil para el desarrollo de la instrumentación de CPC visualizar los patrones de flujo que dan lugar a la mezcla y sedimentación en la cámara de CPC con una cámara asincrónica y un estroboscopio activados por el rotor de CPC. [58]

Modos de funcionamiento

Los instrumentos hidrodinámicos e hidrostáticos antes mencionados pueden emplearse de diversas maneras o en distintos modos de funcionamiento para satisfacer las necesidades de separación particulares del científico. Se han ideado muchos modos de funcionamiento para aprovechar las ventajas y potencialidades de la técnica de cromatografía en contracorriente. En general, los siguientes modos pueden llevarse a cabo con instrumentos disponibles comercialmente.

Fase normal

La elución de fase normal se logra bombeando la fase no acuosa o de un sistema de disolvente bifásico a través de la columna como fase móvil, con una fase estacionaria más polar retenida en la columna. La causa de la nomenclatura original de es relevante. Como las fases estacionarias originales de la cromatografía en papel fueron reemplazadas por materiales más eficientes como tierras de diatomeas (sílice microporosa natural) y seguidas por el gel de sílice moderno , la fase estacionaria de la cromatografía de capa fina era polar (grupos hidroxi unidos a la sílice) y la máxima retención se logró con disolventes no polares como el n-hexano . Luego se utilizaron eluyentes progresivamente más polares para mover los compuestos polares hacia arriba en el plato. Se probaron varias fases unidas a alcanos , siendo C18 la más popular. Las cadenas de alcanos se unieron químicamente a la sílice y se produjo una inversión de la tendencia de elución. De esta manera, la cromatografía en fase estacionaria polar pasó a ser "normal" , y la cromatografía en fase estacionaria no polar pasó a ser "invertida" .

Fase inversa

En la elución en fase reversa (por ejemplo, fase móvil acuosa), la fase acuosa se utiliza como fase móvil con una fase estacionaria menos polar. En la cromatografía en contracorriente, el mismo sistema de disolventes se puede utilizar tanto en modo de fase normal como de fase reversa simplemente cambiando la dirección del flujo de la fase móvil a través de la columna.

Elución-extrusión

La extrusión de la fase estacionaria de la columna al final de un experimento de separación deteniendo la rotación y bombeando solvente o gas a través de la columna fue utilizada por los profesionales de CCC antes de que se sugiriera el término EECCC. [59] En el modo de elución-extrusión (EECCC), la fase móvil se extruye después de un cierto punto cambiando la fase que se bombea al sistema mientras se mantiene la rotación. [60] Por ejemplo, si la separación se ha iniciado con la fase acuosa como fase móvil en un cierto punto, la fase orgánica se bombea a través de la columna, lo que empuja efectivamente hacia afuera ambas fases que están presentes en la columna en el momento del cambio. La muestra completa se eluye en el orden de polaridad (normal o invertida) sin pérdida de resolución por difusión. Solo requiere un volumen de columna de fase solvente y deja la columna llena de fase estacionaria fresca para la separación posterior. [61]

Gradiente

El uso de un gradiente de disolvente está muy desarrollado en la cromatografía en columna, pero es menos común en la CCC. Un gradiente de disolvente se produce aumentando (o disminuyendo) la polaridad de la fase móvil durante la separación para lograr una resolución óptima en un rango más amplio de polaridades . Por ejemplo, se puede emplear un gradiente de fase móvil metanol -agua utilizando heptano como fase estacionaria. Esto no es posible con todos los sistemas de disolventes bifásicos, debido a la pérdida excesiva de fase estacionaria creada por la alteración de las condiciones de equilibrio dentro de la columna. Los gradientes se pueden producir en pasos, [62] o de forma continua. [63]

Modo dual

En el modo dual, las fases móvil y estacionaria se invierten a mitad del experimento de separación. Esto requiere cambiar la fase que se bombea a través de la columna, así como la dirección del flujo. [64] Es probable que la operación en modo dual eluya toda la muestra de la columna, pero el orden de elución se altera al cambiar la fase y la dirección del flujo.

Doble flujo

La cromatografía de contracorriente de flujo dual, también conocida como cromatografía dual, se produce cuando ambas fases fluyen en direcciones opuestas dentro de la columna. Hay instrumentos disponibles para la operación de flujo dual tanto para CCC hidrodinámica como hidrostática. La cromatografía de contracorriente de flujo dual fue descrita por primera vez por Yoichiro Ito en 1985 para CCC de espuma donde se realizaban separaciones de gas-líquido. [65] Las separaciones líquido-líquido siguieron pronto. [66] El instrumento de cromatografía de contracorriente debe modificarse para que ambos extremos de la columna tengan capacidades de entrada y salida. Este modo puede adaptarse a separaciones continuas o secuenciales con la muestra introduciéndose en el medio de la columna o entre dos bobinas en un instrumento hidrodinámico. [67] Una técnica llamada extracción intermitente en contracorriente (ICcE) es un método cuasi continuo donde el flujo de las fases se alterna "intermitentemente" entre la elución de fase normal y la de fase inversa de modo que la fase estacionaria también se alterna. [68]

Reciclaje y secuencial

La cromatografía de reciclaje es un modo de práctica tanto en HPLC [69] como en CCC. [70] En la cromatografía de reciclaje, los compuestos objetivo se reintroducen en la columna después de que se eluyen. Cada paso a través de la columna aumenta el número de platos teóricos que experimentan los compuestos y mejora la resolución cromatográfica. El reciclaje directo debe realizarse con un sistema de disolvente isocrático. Con este modo, el eluyente se puede volver a cromatografiar selectivamente en la misma columna o en una diferente para facilitar la separación. [71] Este proceso de reciclaje selectivo se ha denominado "corte de corazón" y es especialmente eficaz para purificar compuestos objetivo seleccionados con cierta pérdida de recuperación. [72] El proceso de volver a separar fracciones seleccionadas de un experimento cromatográfico con otro método cromatográfico ha sido practicado durante mucho tiempo por los científicos. El reciclaje y la cromatografía secuencial es una versión simplificada de este proceso. En la CCC, las características de separación de la columna se pueden modificar simplemente cambiando la composición del sistema de solvente bifásico. [73]

Intercambio iónico y refinación por zonas de pH

En un experimento CCC convencional, el sistema de disolvente bifásico se preequilibra antes de que el instrumento se llene con la fase estacionaria y se equilibre con la fase móvil. Se ha creado un modo de intercambio iónico modificando ambas fases después del preequilibrio. [74] Generalmente, se añade un desplazador iónico (o eluyente) a la fase móvil y un retenedor iónico a la fase estacionaria. Por ejemplo, la fase móvil acuosa puede contener NaI como desplazador y la fase estacionaria orgánica puede modificarse con la sal de amonio cuaternario denominada Aliquat 336 como retenedor. [75] El modo conocido como refinado de zona de pH es un tipo de modo de intercambio iónico que utiliza ácidos y/o bases como modificadores del disolvente. [76] Normalmente, los analitos se eluyen en un orden determinado por sus valores de pKa . Por ejemplo, se aislaron 6 alcaloides oxindólicos de una muestra de 4,5 g de extracto de tallo de Gelsemium elegans con un sistema de disolvente bifásico compuesto de hexano-acetato de etilo-metanol-agua (3:7:1:9, v/v) donde se añadió 10 mM de trietilamina (TEA) a la fase estacionaria orgánica superior como retenedor y 10 mM de ácido clorhídrico (HCl) a la fase móvil acuosa como eluyente. [77] Los modos de intercambio iónico, como el refinado por zonas de pH, tienen un potencial tremendo porque se pueden lograr altas cargas de muestra sin sacrificar el poder de separación. Funciona mejor con compuestos ionizables como alcaloides que contienen nitrógeno o ácidos grasos que contienen ácido carboxílico. [78]

Aplicaciones

La cromatografía de contracorriente y las técnicas de separación líquido-líquido relacionadas se han utilizado tanto a escala industrial como de laboratorio para purificar una amplia variedad de sustancias químicas. Las realizaciones de separación incluyen proteínas, [79] ADN, [80] cannabidiol (CBD) de Cannabis Sativa [81] antibióticos, [82] vitaminas, [83] productos naturales , [31] productos farmacéuticos, [52] iones metálicos, [84] pesticidas, [85] enantiómeros , [86] hidrocarburos poliaromáticos de muestras ambientales, [87] enzimas activas, [88] y nanotubos de carbono . [89] La cromatografía de contracorriente es conocida por su alto rango dinámico de escalabilidad: con esta técnica se pueden obtener componentes químicos purificados en cantidades de miligramos a kilogramos. [90] También tiene la ventaja de acomodar muestras químicamente complejas con partículas no disueltas.

Véase también

Referencias

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