Cromatografía en el procesamiento de sangre

La cromatografía es un método físico de separación que distribuye los componentes que se desean separar entre dos fases: una estacionaria (fase fija) y otra móvil que se desplaza en una dirección determinada. La precipitación con etanol frío, desarrollada por Cohn en 1946, manipula el pH, la fuerza iónica, la concentración de etanol y la temperatura para precipitar diferentes fracciones proteicas del plasma. Las técnicas cromatográficas utilizan intercambio iónico, filtración en gel y resinas de afinidad para separar las proteínas. Desde la década de 1980, se ha consolidado como un método eficaz para purificar componentes sanguíneos con fines terapéuticos.

El plasma sanguíneo es el componente líquido de la sangre, que contiene proteínas disueltas, nutrientes, iones y otros componentes solubles. En la sangre total, los glóbulos rojos , los glóbulos blancos y las plaquetas se encuentran suspendidos en el plasma. El objetivo de la purificación y el procesamiento del plasma es extraer materiales específicos presentes en la sangre y utilizarlos para la restauración y reparación. El plasma sanguíneo está compuesto por varios componentes, entre ellos la proteína albúmina . La albúmina es una proteína altamente soluble en agua con considerable estabilidad estructural. Sirve como vehículo de transporte para materiales como hormonas, enzimas, ácidos grasos, iones metálicos y medicamentos. También se utiliza con fines terapéuticos, siendo esencial para la restauración y el mantenimiento del volumen sanguíneo circulante en situaciones críticas como traumatismos graves o cirugías. Con poco margen de error, es necesario disponer de muestras extremadamente puras y libres de impurezas en cantidad suficiente. El plasma sanguíneo humano es importante para el organismo, ya que permite el almacenamiento de nutrientes, entre otros.

Tradicionalmente, el proceso Cohn, que incorpora fraccionamiento con etanol frío, se ha utilizado para la purificación de albúmina. Sin embargo, a principios de la década de 1980 comenzaron a adoptarse métodos cromatográficos de separación. El desarrollo continuó entre el inicio del fraccionamiento Cohn en 1946 y el inicio de la cromatografía en 1983. En 1962, se creó el proceso Kistler & Nistchmann, derivado del proceso Cohn. Los procesos cromatográficos comenzaron a consolidarse en 1983. En la década de 1990, se crearon los procesos Zenalb y CSL Albumex, que incorporaban la cromatografía con algunas variaciones.

El método general para utilizar la cromatografía en el fraccionamiento de plasma para la obtención de albúmina es el siguiente: recuperación del sobrenadante I, deslipidación, cromatografía de intercambio aniónico , cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de filtración en gel.

El material purificado recuperado se formula con combinaciones de octanoato de sodio y N-acetil triptofanato de sodio y luego se somete a procedimientos de inactivación viral, incluida la pasteurización a 60  °C.

Esta es una alternativa más eficiente que el proceso Cohn por cuatro razones principales: 1) se necesitaba una automatización fluida y una planta relativamente económica, 2) es más fácil esterilizar el equipo y mantener un buen ambiente de fabricación, 3) los procesos cromatográficos son menos dañinos para la proteína albúmina y 4) se puede lograr un resultado final de albúmina más satisfactorio.

En comparación con el proceso Cohn, la pureza de la albúmina aumentó de aproximadamente el 95 % al 98 % mediante cromatografía, y el rendimiento se incrementó de aproximadamente el 65 % al 85 %. Pequeños aumentos porcentuales marcan la diferencia en mediciones sensibles como la pureza. Sin embargo, la cromatografía presenta una gran desventaja relacionada con la economía del proceso. Si bien el método es eficiente desde el punto de vista del procesamiento, adquirir el equipo necesario es una tarea compleja. Se requiere maquinaria de gran tamaño, y durante mucho tiempo la falta de disponibilidad de equipos dificultó su uso generalizado. Actualmente, los componentes son más accesibles, pero aún se encuentra en desarrollo y posiblemente estará lista en el futuro para beneficiar al mundo.

La integración de métodos tradicionales y modernos es una forma útil de procesar la albúmina.

El método de fraccionamiento de Cohn con cromatografía consta de tres pasos principales: 1) se eliminan los factores I, II y III mediante fraccionamiento con etanol frío; 2) se realizan procedimientos de intercambio iónico y cromatografía de flujo rápido con Sepharose ; y 3) se lleva a cabo una filtración en gel. El resultado es una albúmina con niveles de aluminio un 9 % menores y un tiempo de procesamiento casi el doble de rápido.

Aunque fue difícil lograr la adopción generalizada de los métodos de procesamiento cromatográfico, la expansión global es un proceso en curso. Diversos componentes sanguíneos deben estar fácilmente disponibles en varios centros de tratamiento médico en todo el mundo. El Instituto de Medicina Transfusional de Skopje , en Macedonia del Norte, es un centro de fraccionamiento de plasma en los Balcanes. Su proceso modernizado de purificación de albúmina consta de cinco pasos:

1. El material de partida es plasma que ha sido pretratado mediante centrifugación ,
2. Se realiza una ronda de filtración en gel,
3. Se realiza un intercambio iónico en DEAE Sepharose para unir la albúmina a la columna,
4. La albúmina se eluye con un tampón de acetato de sodio y
5. Pulido final con filtración en gel.

El resultado final es un lote de albúmina altamente puro y seguro, 100 % apirógeno , estéril y libre del virus VIH activo . La pureza del producto es superior al 98 % y su contenido proteico es de aproximadamente 50 g/L.

Existen otros métodos de procesamiento de plasma, pero generalmente no proporcionan la resolución o pureza de los métodos cromatográficos. La extracción líquida de dos fases puede realizarse utilizando sistemas acuosos de dos fases de polietilenglicol (PEG)-fosfato , con una capa superior rica en PEG y una capa inferior rica en fosfato. Aunque este método es algo útil para la recuperación de proteínas, no funciona tan bien para la recuperación de otros componentes sanguíneos. El fraccionamiento por membrana tiene la ventaja de una pérdida mínima de proteínas y una alta eliminación de componentes plasmáticos patológicos. Este método incorpora procesos como la termofiltración y la aplicación de flujo pulsátil. El sistema de membrana de dos etapas más reciente utiliza un circuito de recirculación de alto flujo que es eficaz para la eliminación del colesterol LDL . Puede resultar útil para pacientes con arterias obstruidas y otros problemas cardiovasculares relacionados con el colesterol. La adsorción por lotes, por ejemplo, en medios de intercambio iónico, solo es útil cuando se trabaja con muestras de plasma más pequeñas, típicamente 200 ml o menos. La adsorción por lotes recupera el producto en un volumen mayor de tampón de elución que la cromatografía en columna o la cromatografía frontal, y el producto resultante, más diluido, requiere concentración, normalmente en un sistema de membrana, lo que puede provocar la pérdida de producto por adsorción irreversible a la membrana.