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Sistema libre de células

Un sistema libre de células es una herramienta in vitro ampliamente utilizada para estudiar reacciones biológicas que ocurren dentro de las células , independientemente de un si...

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Un sistema libre de células es una herramienta in vitro ampliamente utilizada para estudiar reacciones biológicas que ocurren dentro de las células , independientemente de un sistema celular completo, lo que reduce las interacciones complejas que suelen encontrarse al trabajar con una célula completa. [ 1 ] Mediante ultracentrifugación se pueden aislar fracciones subcelulares para obtener la maquinaria molecular que se puede utilizar en reacciones en ausencia de muchos de los demás componentes celulares. [ 2 ] Se han utilizado componentes internos de células eucariotas y procariotas para la creación de estos entornos simplificados. [ 3 ] [ 4 ] Estos sistemas han permitido el surgimiento de la biología sintética libre de células , proporcionando control sobre la reacción que se examina, así como sobre su rendimiento, y disminuyendo las consideraciones que de otro modo se invocarían al trabajar con células vivas más sensibles. [ 5 ]

Tipos

Los sistemas libres de células se pueden dividir en dos clasificaciones principales: basados ​​en extractos celulares, que extraen componentes del interior de una célula completa para su uso externo, y basados ​​en enzimas purificadas, que utilizan componentes purificados de las moléculas que se sabe que participan en un proceso determinado. [ 6 ] [ 7 ] El tipo basado en extractos celulares es susceptible a problemas como la rápida degradación de los componentes fuera de su huésped, como se muestra en un estudio de Kitaoka et al. donde un sistema de traducción libre de células basado en Escherichia coli ( E. coli ), del tipo basado en extractos celulares, tuvo la plantilla de ARNm degradada muy rápidamente y provocó la detención de la síntesis de proteínas . [ 8 ]

Preparación

Los métodos de preparación varían según las circunstancias de cada tipo de sistema libre de células.

A base de extracto celular

El ganador del Premio Nobel Eduard Buchner fue posiblemente el primero en presentar un sistema libre de células utilizando extractos de levadura , pero desde entonces se han encontrado fuentes alternativas. [ 9 ] [ 10 ] E. coli , germen de trigo y reticulocitos de conejo han demostrado ser útiles para crear sistemas libres de células mediante la extracción de sus componentes internos. [ 3 ] [ 11 ] Los extractos de E. coli 30S se han obtenido, por ejemplo, moliendo las bacterias con alúmina , seguido de una limpieza adicional. [ 12 ] De manera similar, el germen de trigo se ha molido con arena lavada con ácido o vidrio en polvo para abrir las membranas celulares . [ 13 ] [ 14 ] Los reticulocitos de conejo se han lisado en una solución de MgCl 2 y se ha filtrado el extracto de las membranas mediante centrifugación. [ 15 ]

Usos

Los biosistemas de biotransformación de vías sintéticas libres de células se proponen como una nueva plataforma de biofabricación de bajo costo en comparación con la fermentación microbiana utilizada durante miles de años. [ 3 ] [ 16 ] Los biosistemas libres de células tienen varias ventajas adecuadas para aplicaciones industriales: [ 6 ]

  • Por lo general, se logran rendimientos de producto muy altos sin la formación de subproductos ni la síntesis de masa celular. Por ejemplo, con una vía enzimática sintética, a partir de la reacción con almidón y agua.
C 6 H 10 O 5 (l) + 7 H 2 O (l) → 12 H 2 (g) + 6 CO 2 (g),
Se han producido casi 12 H₂ por unidad de glucosa de polisacáridos y agua , tres veces el rendimiento teórico de los mejores microorganismos anaeróbicos productores de hidrógeno . [ 17 ]

síntesis de proteínas

Los biosistemas in vitro pueden controlarse y accederse fácilmente sin membranas. [ 16 ] Cabe destacar que, en un trabajo que les valió un premio Nobel, el experimento de Nirenberg y Matthaei utilizó un sistema libre de células, del tipo basado en extractos celulares, para incorporar aminoácidos seleccionados marcados radiactivamente en proteínas sintetizadas con 30S extraído de E. coli . [ 12 ] [ 21 ] Estudios más recientes, como el realizado por Spirin et al. con versiones procariotas y eucariotas de su sistema de traducción libre de células, también han sintetizado proteínas con mayor producción, incorporando técnicas como el flujo continuo para agregar materiales y eliminar productos. [ 22 ] Con tales avances en el rendimiento, se han ampliado las aplicaciones de productividad, como la síntesis de proteínas de fusión para servir potencialmente como vacunas para linfomas de células B. [ 23 ] Además , la síntesis de proteínas libre de células se está convirtiendo en una nueva alternativa para la síntesis rápida de proteínas. [ 6 ]

Manipulación metabólica

La ingeniería de procesos metabólicos se ha logrado mediante sistemas libres de células. [ 24 ] [ 10 ] [ 3 ] Bujara et al. , por ejemplo, pudieron utilizar extractos de la red glucolítica , que consisten en enzimas de E. coli que producen dihidroxiacetona fosfato , para analizar en tiempo real las concentraciones de metabolitos mientras alteraban los niveles de enzimas, con el resultado de una producción óptima de dihidroxiacetona fosfato . [ 25 ] Además, Calhoun y Swartz pudieron utilizar un intermediario glucolítico para alimentar un sistema libre de células, lo que permitió una generación de ATP relativamente económica en comparación con el uso de reactivos en reacciones de fosfoenolpiruvato . [ 26 ]

Incorporación de aminoácidos no naturales

También se han utilizado sistemas libres de células para incorporar aminoácidos no naturales . [ 26 ] [ 27 ] Shimizu et al. lograron cambiar un codón de parada a un codón de sentido omitiendo el factor de liberación RF1 , lo que indica la capacidad de insertar los aminoácidos deseados en situaciones no naturales. Esto es útil en sistemas donde trabajar dentro de una célula es problemático, como el proceso de metabolismo de aminoácidos que impide el marcaje específico de aminoácidos que sería útil en la espectroscopia de RMN multidimensional . [ 28 ] Kigawa et al. lograron marcar con éxito aminoácidos en un sistema libre de células donde el metabolismo de aminoácidos ya no estaba presente, lo que hace que dichos sistemas sean útiles para estudios de RMN. [ 28 ]

Referencias

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  2. ↑ "MeSH Browser" . meshb.nlm.nih.gov . Consultado el 18 de octubre de 2017 .
  3. 1 2 3 4 Gregorio, Nicole E.; Levine, Max Z.; Oza, Javin P. (2019). "Guía del usuario para la síntesis de proteínas sin células" . Métodos y protocolos . 2 (1): 24. doi : 10.3390/mps2010024 . PMC 6481089. PMID 31164605 .  
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