Arcoiris cerebral

El método Brainbow es un proceso mediante el cual las neuronas individuales del cerebro pueden distinguirse de las neuronas vecinas mediante el uso de proteínas fluorescentes. Al expresar aleatoriamente diferentes proporciones de derivados rojos, verdes y azules de la proteína fluorescente verde en neuronas individuales, es posible marcar cada neurona con un color distintivo. Este proceso ha sido una importante contribución al campo de la conectómica neuronal .

La técnica fue desarrollada originalmente en 2007 por un equipo dirigido por Jeff W. Lichtman y Joshua R. Sanes , ambos en la Universidad de Harvard . ^[1] La técnica original ha sido adaptada recientemente para su uso con otros organismos modelo de investigación, incluida la mosca de la fruta ( Drosophila melanogaster ), el pez cebra ( Danio rerio ^[2] ) y Arabidopsis thaliana . ^[3]

Mientras que las técnicas de etiquetado anteriores permitían el mapeo de solo unas pocas neuronas, este nuevo método permite iluminar de manera simultánea y diferencial más de 100 neuronas mapeadas de manera diferente de esta manera. Esto da lugar a su característica apariencia multicolor en las imágenes, lo que le valió su nombre y le valió premios en concursos de fotografía científica. ^{[ cita requerida ]}

Brainbow fue desarrollado inicialmente por Jeff W. Lichtman y Joshua R. Sanes en la Universidad de Washington en St. Louis . ^[1] El equipo construyó Brainbow utilizando un proceso de dos pasos: primero, se generó un constructo genético específico que podría recombinarse en múltiples disposiciones para producir uno de tres o cuatro colores según las proteínas fluorescentes (XFP) particulares que se implementaran. ^[4] A continuación, se insertaron múltiples copias del mismo constructo transgénico en el genoma de la especie objetivo, lo que resultó en la expresión aleatoria de diferentes proporciones de XFP y, posteriormente, provocó que diferentes células exhibieran una variedad de tonos coloridos. [ ^4]

Brainbow se creó originalmente como una mejora de las técnicas de neuroimagen más tradicionales , como la tinción de Golgi y la inyección de colorante, que presentaban graves limitaciones a los investigadores en su capacidad para visualizar la intrincada arquitectura de los circuitos neuronales en el cerebro . ^[1] Mientras que las técnicas más antiguas solo podían teñir células con una gama restringida de colores, a menudo utilizando ratones transgénicos bicolores y tricolores para revelar información limitada con respecto a las estructuras neuronales, Brainbow es mucho más flexible ya que tiene la capacidad de etiquetar con fluorescencia neuronas individuales con hasta aproximadamente 100 tonos diferentes para que los científicos puedan identificar e incluso diferenciar entre procesos dendríticos y axónicos . ^[4] Al revelar información tan detallada sobre la conectividad y los patrones neuronales, a veces incluso in vivo, los científicos a menudo pueden inferir información sobre las interacciones neuronales y su impacto posterior sobre el comportamiento y la función. Por lo tanto, Brainbow llenó el vacío dejado por los métodos de neuroimagen anteriores.

Con la reciente aparición de Brainbow en la neurociencia , los investigadores ahora pueden construir mapas específicos de circuitos neuronales e investigar mejor cómo se relacionan con diversas actividades mentales y sus comportamientos conectados (es decir, Brainbow revela información sobre las interconexiones entre neuronas y sus interacciones posteriores que afectan la funcionalidad general del cerebro). Como una extrapolación adicional de este método, Brainbow también se puede utilizar para estudiar trastornos tanto neurológicos como psicológicos mediante el análisis de las diferencias en los mapas neuronales. ^[4]

Las técnicas de Brainbow se basan en la recombinación Cre-Lox , en la que la proteína recombinasa Cre impulsa la inversión o escisión del ADN entre los sitios loxP. El método Brainbow original incluye tanto Brainbow-1 como Brainbow-2, que utilizan diferentes formas de recombinación cre/lox. Brainbow-3, una versión modificada de Brainbow-1, se desarrolló en 2013. ^[5] Para todos los subtipos de Brainbow, la expresión de un XFP determinado es un evento estocástico o aleatorio.

Brainbow-1 utiliza construcciones de ADN con diferentes genes de proteínas fluorescentes (XFP) separados por formas mutantes y canónicas de loxP. Esto crea un conjunto de posibilidades de escisión mutuamente excluyentes, ya que la recombinación mediada por cre ocurre solo entre sitios loxP idénticos. ^[1] Después de que ocurre la recombinación, la proteína fluorescente que queda directamente después del promotor se expresa de manera única. Por lo tanto, una construcción con cuatro XFP separados por tres sitios loxP diferentes, tres eventos de escisión y la construcción original puede producir cuatro proteínas fluorescentes diferentes. ^[4]

Brainbow-2 utiliza la escisión e inversión de Cre para permitir múltiples posibilidades de expresión en una construcción dada. En un segmento de ADN con dos XFP de orientación opuesta, Cre inducirá un evento de inversión aleatorio que deja una proteína fluorescente en la orientación adecuada para la expresión. Si dos de estas secuencias invertibles están alineadas, son posibles tres eventos de inversión diferentes. Cuando también se consideran los eventos de escisión, se expresará una de las cuatro proteínas fluorescentes para una combinación dada de escisiones e inversiones de Cre.

Brainbow-3 conserva el formato loxP de Brainbow-1, pero reemplaza los genes RFP, YFP y CFP con mOrange2, EGFP y mKate2. Se eligieron mO2, EGFP y mK2 porque sus espectros de excitación y emisión fluorescentes se superponen mínimamente y porque comparten una homología de secuencia mínima, lo que permite el diseño de anticuerpos selectivos que se pueden usar para detectarlos en protocolos inmunohistoquímicos . Brainbow-3 también aborda el problema del llenado desigual de neuronas con XFP mediante el uso de derivados farnesilados de los XFP, que se transportan de manera más uniforme a las membranas neuronales. ^[5]

Brainbow se implementa in vivo mediante el cruce de dos cepas de organismos transgénicos : una que expresa la proteína Cre y otra que ha sido transfectada con varias versiones de un constructo loxP/XFP. El uso de múltiples copias del transgén permite que las XFP se combinen de una manera que puede dar uno de aproximadamente 100 colores diferentes. ^[4] De esta manera, cada neurona se etiqueta con un tono diferente en función de su expresión combinatoria y estocástica de proteínas fluorescentes.

Para esclarecer los patrones de expresión diferencial de XFP en una forma visible, se toman imágenes de cortes cerebrales con microscopía confocal . Cuando se expone a un fotón con su longitud de onda de excitación particular, cada fluoróforo emite una señal que se recoge en un canal rojo, verde o azul, y la combinación de luz resultante se analiza con un software de análisis de datos. ^[1] La superposición de neuronas de colores diferenciales permite desentrañar visualmente circuitos neuronales complejos.

Hasta la fecha, Brainbow se ha probado principalmente en ratones; sin embargo, la técnica básica descrita anteriormente también se ha modificado para su uso en estudios más recientes desde la aparición del método original introducido en 2007.

El cerebro del ratón tiene 75.000.000 de neuronas y es más similar a un cerebro humano que la drosophila y otros organismos comúnmente utilizados para modelar esta técnica, como C. elegans . Los ratones fueron los primeros organismos en los que se empleó con éxito el método Brainbow de neuroimagen. ^[1] Livet et al. (2007) desarrollaron dos versiones de ratones Brainbow utilizando Brainbow-1 y Brainbow-2, que se describen anteriormente. ^[1] Al utilizar estos métodos para crear un mapa completo y rastrear los axones de un músculo de ratón, es necesario recopilar decenas de miles de imágenes y compilarlas en pilas para crear un esquema completo. ^[4] Luego es posible rastrear cada axón motor y sus contactos sinápticos para construir un conectoma completo del músculo.

Más ejemplos de neuronas examinadas utilizando la técnica Brainbow en ratones transgénicos se encuentran en el nervio motor que inerva los músculos del oído, los tractos axónicos en el tronco encefálico y el giro dentado del hipocampo . ^[4]

La complejidad del cerebro de Drosophila , que consta de unas 100.000 neuronas, lo convierte en un candidato excelente para la implementación de técnicas de neurofisiología y neurociencia como Brainbow. De hecho, Stefanie Hampel et al. (2011) combinaron Brainbow junto con herramientas de orientación genética para identificar neuronas individuales dentro del cerebro de Drosophila y varios linajes neuronales. ^[6] Una de las herramientas de orientación genética fue un sistema de expresión binaria GAL4/UAS que controla la expresión de UAS-Brainbow y dirige la expresión a pequeños grupos de neuronas. La utilización de métodos "Flip Out" aumentó la resolución celular del constructo reportero. La expresión de proteínas fluorescentes, como con el Brainbow original, dependía de la recombinación de Cre correspondiente a los sitios lox coincidentes. Hampel et al. (2011) también desarrollaron su propia variación de Brainbow (dBrainbow), basada en el etiquetado de anticuerpos de epítopos en lugar de fluorescencia endógena. ^[6] Dos copias de su constructo producen seis colores brillantes y separables. Esto, junto con las simplificaciones en la asignación de colores, les permitió observar las trayectorias de cada neurona a lo largo de largas distancias. En concreto, rastrearon las neuronas motoras desde el lóbulo antenal hasta las uniones neuromusculares, lo que les permitió identificar los objetivos musculares específicos de cada neurona.

En última instancia, esta técnica proporciona la capacidad de mapear eficazmente los circuitos neuronales en Drosophila para que los investigadores puedan descubrir más información sobre la estructura cerebral de este invertebrado y cómo se relaciona con su comportamiento resultante.

Como ocurre con cualquier técnica de neuroimagen , Brainbow tiene una serie de limitaciones que se derivan de los métodos necesarios para realizarla. Por ejemplo, el proceso de reproducción de al menos dos cepas de animales transgénicos a partir de células madre embrionarias es complejo y lleva mucho tiempo. Incluso si se crean con éxito dos especies transgénicas , no todas sus crías mostrarán la recombinación. Por lo tanto, esto requiere una planificación exhaustiva antes de realizar un experimento. ^[4]

Además, debido a la naturaleza aleatoria de la expresión de las proteínas fluorescentes, los científicos no pueden controlar con precisión el etiquetado de los circuitos neuronales, lo que puede resultar en una mala identificación de neuronas específicas.

El uso de Brainbow en poblaciones de mamíferos también se ve obstaculizado por la increíble diversidad de neuronas del sistema nervioso central . La gran densidad de neuronas junto con la presencia de largos tractos de axones dificulta la visualización de regiones más grandes del SNC con alta resolución. Brainbow es más útil cuando se examina la resolución de una sola célula en el contexto de un entorno multicelular complejo. Sin embargo, debido a los límites de resolución de la microscopía óptica , no se logra fácilmente la identificación concluyente de las conexiones sinápticas entre neuronas. Este problema se evita en cierta medida mediante el uso de marcadores sinápticos para complementar el uso de la microscopía óptica en la visualización de las conexiones sinápticas. ^[7]

• Buenas prácticas agrarias
• Fluorescencia
• Recombinación Cre-Lox

• Podcast en el programa Science Friday de NPR
• "Brainbow" Un uso interesante de GFP