Bioreportero

La luciferasa es el nombre genérico de una enzima que cataliza una reacción de emisión de luz. Las luciferasas se encuentran en bacterias, algas, hongos, medusas, insectos, camarones y calamares, y la luz resultante que producen estos organismos se denomina bioluminiscencia. En las bacterias, los genes responsables de la reacción de emisión de luz (los genes lux ) se han aislado y utilizado ampliamente en la construcción de biorreporteros que emiten una luz azul verdosa con una intensidad máxima a 490  nm. ^{[ 2 ]} Existen tres variantes de lux : una que funciona a < 30 °C, otra a < 37 °C y una tercera a < 45 °C. El sistema genético lux consta de cinco genes: luxA , luxB , luxC , luxD y luxE . Dependiendo de la combinación de estos genes, se pueden construir diferentes tipos de biorreporteros bioluminiscentes .

Los biorreporteros luxAB contienen únicamente los genes luxA y luxB , que en conjunto generan la señal luminosa. Sin embargo, para que la reacción de emisión de luz se complete, es necesario suministrar un sustrato a la célula. Normalmente, esto se logra mediante la adición del compuesto químico decanal en algún momento del bioensayo. Se han desarrollado numerosos biorreporteros luxAB en sistemas celulares bacterianos, de levadura, de insectos, de nematodos, de plantas y de mamíferos.

En lugar de contener únicamente los genes luxA y luxB , los biorreporteros pueden contener los cinco genes del casete lux , lo que permite un sistema de generación de luz completamente independiente que no requiere la adición de sustrato ni la excitación mediante una fuente de luz externa. Así, en este bioensayo, el biorreportero se expone simplemente a un analito objetivo y se observa un aumento cuantitativo de la bioluminiscencia, a menudo en menos de una hora. Su rapidez y facilidad de uso, junto con la posibilidad de realizar el bioensayo repetidamente en tiempo real y en línea, hacen que los biorreporteros luxCDABE sean extremadamente atractivos. Por consiguiente, se han incorporado a una amplia gama de metodologías de detección, desde la detección de contaminantes ambientales hasta la monitorización en tiempo real de infecciones por patógenos en ratones vivos.

Los biorreporteros lux no específicos se utilizan habitualmente para la detección de toxinas químicas. Suelen estar diseñados para bioluminiscer de forma continua. Tras la exposición a una toxina química, la célula muere o su actividad metabólica se ve retardada, lo que provoca una disminución de los niveles de luz bioluminiscente . Su aplicación más conocida es el ensayo Microtox, donde, tras una breve exposición a diversas concentraciones de la muestra, la disminución de la bioluminiscencia puede correlacionarse con los niveles relativos de toxicidad . ^{[ 3 ] [ 4 ]}

La luciferasa de luciérnaga cataliza una reacción que produce luz visible en el  rango de 550 a 575 nm. También existe una luciferasa de escarabajo clic que produce luz con un pico cercano a los 595  nm. Ambas luciferasas requieren la adición de un sustrato exógeno (luciferina) para que se produzca la reacción lumínica. Se han desarrollado numerosos biorreporteros basados ​​en luciferasa para la detección de una amplia gama de compuestos inorgánicos y orgánicos de interés ambiental. Sin embargo, las aplicaciones más prometedoras probablemente se basen en la introducción del código genético de la luciferasa de luciérnaga en otras células y tejidos eucariotas. ^{[ 5 ]}

La aequorina es una fotoproteína aislada de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria . Tras la adición de iones de calcio (Ca2+) y coelenterazina, se produce una reacción que genera luz azul en el  rango de 460 a 470 nm. La aequorina se ha incorporado a líneas celulares B humanas para la detección de bacterias y virus patógenos en lo que se conoce como el ensayo Cell CANARY (Análisis Celular y Notificación de Riesgos y Rendimientos de Antígenos). ^{[ 10 ]} Las células B se modifican genéticamente para producir aequorina. Tras la exposición a antígenos de diferentes patógenos, las células B recombinantes emiten luz como resultado de la activación de una cascada de señalización intracelular que libera iones de calcio dentro de la célula.

La proteína verde fluorescente (GFP) es una fotoproteína aislada y clonada de la medusa Aequorea victoria . ^{[ 11 ]} También se han aislado variantes del pez Renilla reniformis . La GFP, al igual que la aequorina, produce una señal fluorescente azul, pero sin la necesidad de añadir un sustrato exógeno. Basta con una fuente de luz ultravioleta para activar las propiedades fluorescentes de la fotoproteína. Esta capacidad de autofluorescencia hace que la GFP sea muy útil en ensayos de biodetección, ya que puede utilizarse en línea para monitorizar células vivas intactas. Además, la posibilidad de modificar la GFP para que produzca emisiones de luz distintas del azul (es decir, cian, rojo y amarillo) permite su uso como detector de múltiples analitos. Por consiguiente, la GFP se ha utilizado ampliamente en construcciones de biorreporteros en huéspedes bacterianos, de levadura, nematodos, plantas y mamíferos.

La uroporfirinógeno (urógeno) III metiltransferasa (UMT) cataliza una reacción que produce dos productos fluorescentes que generan una fluorescencia rojo-anaranjada en el  rango de 590 a 770 nm cuando se iluminan con luz ultravioleta . ^{[ 12 ]} Por lo tanto, al igual que con la GFP, no se requiere la adición de sustratos exógenos. La UMT se ha utilizado como biorreportero para la selección de plásmidos recombinantes , como marcador de la transcripción génica en células bacterianas, de levadura y de mamíferos, y para la detección de sales tóxicas como el arsenito y el antimonio .