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endonucleasa AP

Diagrama de cinta de APE1. PDB = 1de9. [ 1 ] La endonucleasa apurínica/apirimidínica ( AP ) es una enzima que participa en la vía de reparación por escisión de bases del ADN (BE...

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Diagrama de cinta de APE1. PDB = 1de9. [ 1 ]

La endonucleasa apurínica/apirimidínica ( AP ) es una enzima que participa en la vía de reparación por escisión de bases del ADN (BER). Su función principal en la reparación de nucleótidos dañados o mal emparejados en el ADN es crear una muesca en el esqueleto fosfodiéster del sitio AP , que se genera cuando la ADN glicosilasa elimina la base dañada.

Existen cuatro tipos de endonucleasas AP que se han clasificado según su mecanismo y sitio de incisión. Las endonucleasas AP de clase I ( EC 4.2.99.18 ) cortan en la región 3' de los sitios AP mediante un mecanismo de β-liasa, dejando un aldehído insaturado, denominado residuo 3'-(4-hidroxi-5-fosfo-2-pentenal), y un fosfato en la región 5'. Las endonucleasas AP de clase II cortan el ADN en la región 5' de los sitios AP mediante un mecanismo hidrolítico, dejando un hidroxilo en la región 3' y un residuo de fosfato de desoxirribosa en la región 5'. [ 2 ] Las endonucleasas AP de clase III y clase IV también cortan el ADN en los grupos fosfato en las regiones 3' y 5' del sitio sin base, pero generan un fosfato en la región 3' y un grupo hidroxilo en la región 5'. [ 3 ]

Los humanos poseen dos endonucleasas AP, APE1 y APE2 . APE1 exhibe una actividad endonucleasa AP robusta, que representa más del 95 % de la actividad celular total, y se considera la principal endonucleasa AP en las células humanas. [ 4 ] La endonucleasa AP humana (APE1), al igual que la mayoría de las endonucleasas AP, pertenece a la clase II y requiere un ion Mg²⁺ en su sitio activo para llevar a cabo su función en la reparación por escisión de bases. El homólogo de esta enzima en levaduras es APN1. [ 5 ]

La AP endonucleasa 2 humana (APE2), al igual que la mayoría de las AP endonucleasas, pertenece a la clase II. La actividad exonucleasa de APE2 depende en gran medida de los iones metálicos. Sin embargo, APE2 fue más de cinco veces más activa en presencia de iones de manganeso que de magnesio. [ 4 ] Los dominios conservados implicados en la actividad catalítica se localizan en la parte N-terminal tanto de APE1 como de APE2. Además, la proteína APE2 posee una extensión C-terminal, ausente en APE1, pero presente en homólogos de la APE2 humana, como las proteínas APN2 de S. cerevisiae y S. pombe . [ 4 ]

Estructura de APE1

Los residuos positivos en la superficie de la proteína APE1 (en azul) anclan y curvan el ADN mediante interacciones con los grupos fosfato negativos del ADN. PDB 1de9. [ 1 ]
Los enlaces de hidrógeno entre residuos clave de aminoácidos ayudan a estabilizar la estructura del sitio activo. Además, un residuo con carga negativa (Glu 96) ayuda a mantener el Mg2+ también necesario para estabilizar el sitio AP en su lugar PDB 1de9. [ 1 ]

APE1 contiene varios residuos de aminoácidos que le permiten reaccionar selectivamente con los sitios AP. Tres residuos de APE1 ( Arg 73, Ala 74 y Lys 78) contactan con tres fosfatos de ADN consecutivos en la hebra opuesta a la que contiene el sitio AP, mientras que Tyr 128 y Gly 127 abarcan y ensanchan el surco menor, anclando el ADN para la torsión extrema causada por la interacción entre los residuos positivos que se encuentran en cuatro bucles y una hélice α y los grupos fosfato negativos que se encuentran en el esqueleto fosfodiéster del ADN.

Esta torsión extrema fuerza la porción sin bases del ADN hacia el sitio activo de APE1 . Este sitio activo está delimitado por Phe 266, Trp 280 y Leu 282, que se compactan firmemente con el lado hidrofóbico del sitio AP, discriminando contra los sitios que sí contienen bases. El sitio AP se estabiliza aún más mediante enlaces de hidrógeno del grupo fosfato 5' al sitio AP con Asn 174, Asn212, His 309 y el ion Mg 2+ , mientras que su base huérfana asociada se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno con Met 270. El grupo fosfato 3' al sitio AP se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno con Arg 177. Mientras tanto, un Asp 210 en el sitio activo, que se vuelve más reactivo debido al aumento en su pK a (o el logaritmo negativo de la constante de disociación ácida ) causado por su estabilización mediante enlaces de hidrógeno entre Asn68 y Asn212, activa el nucleófilo que ataca y escinde el esqueleto fosfodiéster y probablemente resulta en la actividad máxima de APE1 observada a un pH de 7,5. [ 1 ]

Mecanismo

La enzima APE1 crea una muesca en el esqueleto fosfodiéster en un sitio abásico (sin base) mediante un sencillo mecanismo de sustitución de acilo. Primero, el residuo Asp210 en el sitio activo desprotona una molécula de agua, que luego puede realizar un ataque nucleofílico sobre el grupo fosfato ubicado en la posición 5´ del sitio AP. A continuación, los electrones de uno de los átomos de oxígeno del grupo fosfato se desplazan hacia abajo, expulsando a otro oxígeno para crear un grupo fosfato libre en la posición 5´ del sitio AP y un grupo OH libre en la posición 3´ del nucleótido normal, ambos estabilizados por el ion Mg²⁺ . [ 1 ]

Mecanismo ilustrado

Inhibición de APE1

Lucanthone

Entre los inhibidores conocidos de APE1 se encuentran el ácido 7-nitroindol-2-carboxílico (NCA) y la lucantona . [ 6 ] Ambas estructuras poseen anillos unidos a cadenas cortas, que se asemejan al anillo de azúcar desoxirribosa sin una base unida ni un enlace fosfodiéster en el ADN. Además, ambas contienen muchos aceptores de enlaces de hidrógeno que pueden interactuar con los donadores de enlaces de hidrógeno en el sitio activo de APE1, lo que provoca que estos inhibidores se adhieran al sitio activo e impidan que la enzima catalice otras reacciones.

APE1 como diana quimiopreventiva

Debido a que APE1 desempeña una función esencial en la vía de reparación por escisión de bases del ADN, se ha convertido en un objetivo para los investigadores que buscan maneras de evitar que las células cancerosas sobrevivan a la quimioterapia. APE1 no solo es necesaria para crear la muesca en la cadena principal del ADN, de modo que las enzimas implicadas posteriormente en la vía BER puedan reconocer el sitio AP, sino que también tiene una función redox que ayuda a activar otras enzimas implicadas en la reparación del ADN. Por lo tanto, la inhibición de APE1 podría aumentar la sensibilidad de las células tumorales, impidiendo así que las células cancerosas persistan después de la quimioterapia. [ 7 ]

actividad de la enzima APE2

APE2 tiene una actividad endonucleasa AP mucho más débil que APE1, pero su actividad exonucleasa 3'-5' es fuerte en comparación con APE1 [ 8 ] y tiene una actividad fosfodiesterasa 3' bastante fuerte. [ 4 ]

La actividad exonucleasa 3'–5' de APE2 tiene la capacidad de hidrolizar ADN dúplex de extremos romos, dúplex de ADN parciales con un extremo 3' hundido o ADN heterodúplex que contiene un hueco de un solo nucleótido. La actividad fosfodiesterasa 3' de APE2 puede eliminar extremos 3' modificados, como el 3'-fosfoglicolato, así como nucleótidos mal emparejados del extremo 3' del cebador de ADN. [ 4 ]

APE2 es necesario para la respuesta de ATR-Chk1 al daño del ADN tras el estrés oxidativo.

Referencias

Las imágenes de gráficos moleculares se produjeron utilizando el paquete UCSF Chimera del Centro de Recursos para Biocomputación, Visualización e Informática de la Universidad de California, San Francisco (financiado por NIH P41 RR-01081). [ 9 ]

  1. 1 2 3 4 5 Clifford D. Mol; Tahide Izumi; Sankar Mitra; John A. Tainer (2000). "Las estructuras y mutantes unidos al ADN revelan la unión abásica del ADN por la reparación y coordinación del ADN de APE1". Nature . 403 (6768): 451– 456. Bibcode : 2000Natur.403..451M . doi : 10.1038/35000249 . PMID 10667800 . S2CID 4373743 .  
  2. ↑ Levin, Joshua D; Demple, Bruce (1990). "Análisis de endonucleasas apurínicas/apirimidínicas de clase II (hidrolíticas) y clase I (beta-liasa) con un sustrato de ADN sintético" . Nucleic Acids Research . 18 (17): 5069– 75. doi : 10.1093/ nar /18.17.5069 . PMC 332125. PMID 1698278 .  
  3. ↑ Gary M. Myles; Aziz Sancar (1989). "Reparación del ADN". Chemical Research in Toxicology . 2 (4): 197– 226. doi : 10.1021/tx00010a001 . PMID 2519777 . 
  4. 1 2 3 4 5 Burkovics P, Szukacsov V, Unk I, Haracska L (2006). "La proteína Ape2 humana tiene una actividad exonucleasa 3'-5' que actúa preferentemente sobre pares de bases mal emparejados" . Nucleic Acids Res . 34 (9): 2508–15 . doi : 10.1093/nar/gkl259 . PMC 1459411. PMID 16687656 .  
  5. ↑ George W. Teebor; Dina R. Marensein; David M. Wilson III (2004). "La endonucleasa AP humana (APE1) demuestra actividad endonucleolítica contra sitios AP en ADN monocatenario". Reparación del ADN . 3 (5): 527– 533. doi : 10.1016/j.dnarep.2004.01.010 . PMID 15084314 . 
  6. ↑ Mark R. Kelley; Melissa L. Fishel (2007). "La proteína de reparación por escisión de bases del ADN Ape1/Ref-1 como objetivo terapéutico y quimiopreventivo". Aspectos moleculares de la medicina . 28 ( 3– 4): 375– 395. doi : 10.1016/j.mam.2007.04.005 . PMID 17560642 . 
  7. ↑ Mark R. Kelley; Meihua Luo; Sarah Delaphlane; Aihua Jiang; April Reed; Ying He; Melissa Fishel; Rodney L. Nyland II; Richard F. Broch; Xizoxi Qiao; Millie M. Georgiadis (2008). "Función de la proteína multifuncional de reparación del ADN y señalización redox Ape1/Ref-1 en células cancerosas y endoteliales: inhibición de la función redox de Ape1 mediante moléculas pequeñas" . Antioxidants & Redox Signaling . 10 (11): 1– 12. doi : 10.1089/ars.2008.2120 . PMC 2587278. PMID 18627350 .  
  8. ↑ Stavnezer J, Linehan EK, Thompson MR, Habboub G, Ucher AJ, Kadungure T, Tsuchimoto D, Nakabeppu Y, Schrader CE (2014). "La expresión diferencial de APE1 y APE2 en los centros germinales promueve la reparación propensa a errores y las mutaciones A:T durante la hipermutación somática" . Proc . Natl. Acad. Sci. USA . 111 (25): 9217–22 . Bibcode : 2014PNAS..111.9217S . doi : 10.1073/pnas.1405590111 . PMC 4078814. PMID 24927551 .  
  9. ↑ EF Pettersen; TD Goddard; CC Huang; GS Couch; DM Greenblat; EC Meng; TE Ferrin (2004). "UCSF Chimera - Un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios" (PDF) . J. Comput. Chem . 25 (13 ) : 1605– 1612. Bibcode : 2004JCoCh..25.1605P . doi : 10.1002/jcc.20084 . PMID 15264254. S2CID 8747218 .  
  • Definición básica de la endonucleasa AP. Archivado el 20 de junio de 2010 en Wayback Machine.
  • Familia 1 de endonucleasas AP en PROSITE
  • Familia 2 de endonucleasas AP en PROSITE
  • Aplicación en reparación de escisión de base de parche largo. Archivado el 29/09/2007 en Wayback Machine.
  • Purificación y caracterización de una endonucleasa apurínica/apirimidínica de células HeLa. Archivado el 29/09/2007 en Wayback Machine.