Ribozima VS

La ribozima satélite de Varkud (VS) es una enzima de ARN que lleva a cabo la escisión de un enlace fosfodiéster . ^{[ 1 ] [ 2 ]}

El ribozima satélite de Varkud (VS) es el ribozima nucleolítico más grande conocido y está incrustado en el ARN VS. El ARN VS es un ARN largo no codificante que existe como ARN satélite y se encuentra en las mitocondrias de Varkud-1C y algunas otras cepas de Neurospora . El ribozima VS contiene características tanto de ARN catalíticos como de intrones del grupo 1. ^{[ 3 ]} El ribozima VS tiene actividad de escisión y ligación y puede realizar ambas reacciones de manera eficiente en ausencia de proteínas. El ribozima VS experimenta transferencia horizontal de genes con otras cepas de Neurospora . ^{[ 4 ]} Los ribozimas VS no tienen nada en común con otros ribozimas nucleolíticos.

El ARN VS posee una estructura primaria, secundaria y terciaria única. La estructura secundaria de la ribozima VS consta de seis dominios helicoidales (Figura 1). El bucle-tallo I forma el dominio del sustrato, mientras que los bucles-tallo II-VI forman el dominio catalítico. Cuando estos dos dominios se sintetizan in vitro por separado, pueden realizar la reacción de autocorte mediante transacción ^{[ 5 ].} El sustrato se une a una hendidura formada por dos hélices. El probable sitio activo de la ribozima es el nucleótido A756, de gran importancia. El bucle A730 y el nucleótido A756 son cruciales para su función, ya que participan en la actividad química de transferencia de fósforo de la ribozima ^{[ 6 ].}

El ARN VS se transcribe como un transcrito multimérico a partir del ADN VS. El ADN VS contiene una región que codifica la transcriptasa inversa necesaria para la replicación del ARN VS. Una vez transcrito, el ARN VS sufre una escisión específica. El ARN VS se autoescinde en un enlace fosfodiéster específico para producir un transcrito monomérico y algunos transcritos multiméricos. Estos transcritos luego se autoligan y forman un ARN VS circular. ^{[ 7 ]} Este ARN VS circular es la forma predominante de VS que se encuentra en Neurospora . La ribozima VS es un pequeño motivo catalítico incrustado dentro de este ARN VS circular. La mayor parte del ARN VS está compuesta por 881 nucleótidos . ^{[ 7 ]}

Estructura secundaria de la ribozima VS. Los bucles están numerados y las hélices apareadas se muestran en rojo.

Estructura terciaria de la ribozima VS. Los bucles están numerados y las hélices apareadas se muestran en rojo. ( PDB : 4r4v )

En estado natural, un motivo de ribozima VS contiene 154 nucleótidos que se pliegan en seis hélices. Su ARN contiene un elemento de autocorte, que se cree que actúa en el procesamiento de intermediarios producidos durante la replicación. ^{[ 8 ]} La estructura en forma de H de la ribozima está organizada por dos uniones de tres vías, que determinan el plegamiento general de la ribozima. Una característica única de la estructura de la ribozima es que incluso si se eliminara la mayor parte de la hélice IV y el extremo distal de la hélice VI, no habría una pérdida significativa de actividad. ^{[ 9 ]} Sin embargo, si se modificaran las longitudes de las hélices III y V, habría una pérdida importante de actividad. Las protuberancias de base de la ribozima, las hélices II y IV, tienen funciones estructurales muy importantes, ya que reemplazarlas con otros nucleótidos no afecta su actividad. Básicamente, la actividad de la ribozima VS depende en gran medida de la secuencia local de las dos uniones de tres vías. La unión de tres vías presente en la ribozima VS es muy similar a la que se observa en la subunidad pequeña (23S) del ARNr . ^{[ 9 ]}

Los sitios activos de la ribozima se encuentran en las uniones helicoidales, las protuberancias y las longitudes de las hélices críticas III y V. Existe un área importante en el bucle interno de la hélice VI, denominada A730; un cambio de una sola base en este bucle provocaría una disminución de la actividad de escisión, pero no se producirían cambios significativos en el plegamiento de la ribozima. Otras mutaciones que afectan la actividad de la ribozima son la metilación y la supresión de iones de manganeso tiofílicos en el sitio A730. ^{[ 10 ]}

El bucle A730 es crucial para la actividad catalítica de la ribozima. Esta funciona como una estación de acoplamiento, donde el sustrato se une a la hendidura entre las hélices II y VI para facilitar la interacción entre el sitio de escisión y el bucle A730. Esta interacción crea un entorno propicio para la catálisis, similar a las interacciones observadas en la ribozima de horquilla . Dentro del bucle A730, la sustitución de A756 por G, C o U conlleva una disminución de 300 veces en la actividad de escisión y ligación.

La prueba de que el bucle A730 es el sitio activo de la ribozima VS es muy evidente, y que A756 juega un papel importante en su actividad. La reacción de escisión funciona mediante un mecanismo de reacción S _N 2. El ataque nucleofílico del oxígeno 2' sobre el fosfato 3' creará un fosfato cíclico 2'3' por la salida del oxígeno 5'. La reacción de ligación ocurre en sentido inverso, en la que el oxígeno 5' ataca al fosfato 3' del fosfato cíclico. ^{[ 11 ]} La forma en que se facilitan ambas reacciones es mediante catálisis ácido-base general que fortalece el nucleófilo de oxígeno al eliminar proteínas unidas y estabilizar los grupos salientes de oxianión mediante protonación. También es importante agregar que si un grupo se comporta como una base en la reacción de escisión, entonces debe actuar como un ácido en la reacción de ligación. En general, los iones metálicos solvatados actúan en la catálisis ácido-base, donde pueden funcionar como ácidos de Lewis que polarizan los átomos de oxígeno del fosfato. Otro factor importante en la velocidad de la reacción de ligación es la dependencia del pH, que corresponde a un pKa de 5,6, el cual no influye en la reacción de escisión. Esta dependencia particular requiere una base protonada en la posición A756 de la ribozima.

Otra estrategia catalítica propuesta es la estabilización de un fosfato pentavalente del estado de transición de la reacción . Este mecanismo probablemente implicaría la formación de enlaces de hidrógeno, como se observa en la ribozima en horquilla ^{[ 12 ].} Además, la proximidad de los grupos del sitio activo entre sí y su orientación espacial contribuirían al mecanismo catalítico. Esto podría acercar el estado de transición y el sustrato para que tenga lugar la reacción de ligación.

Las concentraciones muy altas de cationes bivalentes y monovalentes aumentan la eficiencia de la reacción de escisión. Estos cationes facilitan el apareamiento de bases de la ribozima con el sustrato. ^{[ 3 ]} La velocidad de escisión VS puede acelerarse mediante una alta concentración de cationes, así como mediante el aumento de la concentración de ARN. Por lo tanto, una baja concentración de cualquiera de estos factores limita la velocidad de reacción. Se considera que la función de los cationes es la neutralización de la carga durante el plegamiento del ARN, más que la catálisis.

1. Un fósil molecular del mundo del ARN que ha conservado las funciones de escisión y ligación.

2. La ribozima VS adquirió posteriormente una o más de sus actividades enzimáticas.

La escisión y ligación mediadas por ARN se encuentran en los ARN de autoescisión de los grupos 1 y 2. El ARN VS contiene muchas características de secuencia conservadas con los intrones del grupo 1. Sin embargo, el sitio de empalme de la ribozima VS es diferente del sitio de empalme del intrón del grupo 1, y el sitio de autoescisión de la ribozima VR se encuentra fuera del núcleo del intrón del grupo 1. En la reacción de escisión, la ribozima VS produce 2',3'-fosfato cíclico, y los intrones del grupo 1 producen 3'-hidroxilo. La similitud funcional con los intrones del grupo 1 y, por lo tanto, la diferencia mecanística con respecto a los intrones, apoyan esta hipótesis de que la ribozima VS es una quimera formada por la inserción de un nuevo ARN catalítico en los intrones del grupo 1. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

• Secuencia de nucleótidos y anotación del ADN VS que codifica la ribozima VS (en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica ).