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Sistema de secreción tipo III

Imagen de microscopio electrónico de transmisión de complejos de agujas T3SS aislados de Salmonella Typhimurium . El sistema de secreción de tipo III ( T3SS o TTSS ) es uno de l...

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Imagen de microscopio electrónico de transmisión de complejos de agujas T3SS aislados de Salmonella Typhimurium .

El sistema de secreción de tipo III ( T3SS o TTSS ) es uno de los sistemas de secreción bacteriana que utilizan las bacterias para secretar sus proteínas efectoras en las células huésped para promover la virulencia y la colonización . [ 1 ] [ 2 ] Si bien el sistema de secreción de tipo III se ha considerado ampliamente como equivalente al inyectosoma , muchos argumentan que el inyectosoma es solo una parte del sistema de secreción de tipo III, que también incluye estructuras como el aparato de exportación flagelar. [ 3 ] El T3SS es un complejo proteico en forma de aguja que se encuentra en varias especies de bacterias gramnegativas patógenas .

Descripción general

El términoEl término «sistema de secreción tipo III» se acuñó en 1993. [ 4 ] Este sistema de secreción se distingue de al menos otros cinco sistemas de secreción presentes en bacterias gramnegativas . Muchas bacterias asociadas a animales y plantas poseen sistemas de secreción tipo III (T3SS) similares. Estos T3SS son similares como resultado de la evolución convergente, y el análisis filogenético respalda un modelo en el que las bacterias gramnegativas pueden transferir horizontalmente el casete genético del T3SS a otras especies. Algunos de los T3SS más estudiados pertenecen a especies de:

El T3SS está compuesto por aproximadamente 30 proteínas diferentes, lo que lo convierte en uno de los sistemas de secreción más complejos. Su estructura muestra muchas similitudes con los flagelos bacterianos (estructuras extracelulares largas, rígidas y utilizadas para la motilidad ). Algunas de las proteínas que participan en el T3SS comparten homología de secuencia de aminoácidos con proteínas flagelares. Algunas bacterias que poseen un T3SS también tienen flagelos y son móviles ( por ejemplo, Salmonella ), y otras no ( por ejemplo, Shigella ). Técnicamente hablando, la secreción de tipo III se utiliza tanto para secretar proteínas relacionadas con la infección como componentes flagelares. Sin embargo, el término "secreción de tipo III" se usa principalmente en relación con el aparato de infección. El flagelo bacteriano comparte un ancestro común con el sistema de secreción de tipo III. [ 5 ] [ 6 ]

Los sistemas de secreción tipo III (T3SS) son esenciales para la patogenicidad (la capacidad de infectar) de muchas bacterias patógenas. Los defectos en el T3SS pueden hacer que una bacteria deje de ser patógena. Se ha sugerido que algunas cepas no invasivas de bacterias gramnegativas han perdido el T3SS porque este sistema, energéticamente costoso, ya no les resulta útil. [ 7 ] Si bien los antibióticos tradicionales fueron eficaces contra estas bacterias en el pasado, constantemente surgen cepas resistentes a los antibióticos . Comprender cómo funciona el T3SS y desarrollar fármacos dirigidos específicamente a él se ha convertido en un objetivo importante para muchos grupos de investigación en todo el mundo desde finales de la década de 1990.

Estructura

La característica distintiva del T3SS es la aguja [ 8 ] [ 9 ] (más generalmente, el complejo de la aguja (NC) o el aparato T3SS (T3SA); también llamado inyectosoma cuando se excluye la ATPasa ; véase más adelante). Las proteínas bacterianas que necesitan ser secretadas pasan del citoplasma bacteriano a través de la aguja directamente al citoplasma del huésped. Tres membranas separan los dos citoplasmas: las membranas dobles (membrana interna y externa) de la bacteria Gram negativa y la membrana eucariota. La aguja proporciona un paso suave a través de esas membranas altamente selectivas y casi impermeables. Una sola bacteria puede tener varios cientos de complejos de aguja distribuidos a lo largo de su membrana. Se ha propuesto que el complejo de la aguja es una característica universal de todos los T3SS de bacterias patógenas. [ 10 ]

El complejo de la aguja comienza en el citoplasma de la bacteria, atraviesa las dos membranas y sobresale de la célula. La parte anclada en la membrana es la base (o cuerpo basal) del T3SS. La parte extracelular es la aguja. Una varilla interna conecta la aguja con la base. La aguja, aunque es la parte más grande y prominente del T3SS, está formada por muchas unidades de una sola proteína. Por lo tanto, la mayoría de las proteínas del T3SS son las que forman la base y las que se secretan al huésped. Como se mencionó anteriormente, el complejo de la aguja comparte similitudes con los flagelos bacterianos. Más específicamente, la base del complejo de la aguja es estructuralmente muy similar a la base flagelar; la aguja en sí es análoga al gancho flagelar, una estructura que conecta la base con el filamento flagelar. [ 11 ] [ 12 ]

La base está compuesta por varios anillos circulares y es la primera estructura que se construye en un nuevo complejo de aguja. Una vez completada la base, funciona como una máquina de secreción para las proteínas externas (la aguja). Cuando todo el complejo está completo, el sistema pasa a secretar proteínas destinadas a ser introducidas en las células huésped. Se presume que la aguja se construye de abajo hacia arriba; las unidades de proteína monomérica de la aguja se apilan unas sobre otras, de modo que la unidad en la punta de la aguja es la última en añadirse. La subunidad de la aguja es una de las proteínas T3SS más pequeñas, con un peso molecular aproximado de 9 kDa . Cada aguja está compuesta por entre 100 y 150 subunidades.

La aguja del sistema de secreción tipo III (T3SS) mide aproximadamente entre 60 y 80 nm de longitud y 8  nm de ancho externo. Debe tener una longitud mínima para que otras estructuras bacterianas extracelulares ( adhesinas y la capa de lipopolisacáridos  , por ejemplo) no interfieran con la secreción. El orificio de la aguja tiene un diámetro de 3 nm. La mayoría de las proteínas efectoras plegadas son demasiado grandes para pasar a través de la abertura de la aguja, por lo que la mayoría de las proteínas secretadas deben pasar a través de ella desplegadas , tarea que lleva a cabo la ATPasa en la base de la estructura. [ 13 ]

Proteínas T3SS

Diagrama de las subestructuras individuales del complejo de la aguja de Salmonella typhimurium.

Las proteínas T3SS se pueden agrupar en tres categorías:

  • Proteínas estructurales : forman la base, la varilla interna y la aguja.
  • Proteínas efectoras : se secretan en la célula huésped y promueven la infección o suprimen las defensas de la célula huésped.
  • Las chaperonas se unen a los efectores en el citoplasma bacteriano, los protegen de la agregación y la degradación y los dirigen hacia el complejo de la aguja.

La mayoría de los genes del sistema de secreción tipo III (T3SS) se encuentran organizados en operones . Estos operones se localizan en el cromosoma bacteriano en algunas especies y en un plásmido específico en otras. Salmonella , por ejemplo, posee una región cromosómica donde se concentran la mayoría de los genes del T3SS, denominada isla de patogenicidad de Salmonella (SPI). Shigella , por otro lado, posee un gran plásmido de virulencia que alberga todos los genes del T3SS. Muchas islas de patogenicidad y plásmidos contienen elementos que permiten la transferencia horizontal frecuente de genes de la isla/plásmido a una nueva especie.

Las proteínas efectoras que se secretan a través de la aguja deben ser reconocidas por el sistema, ya que flotan en el citoplasma junto con miles de otras proteínas. El reconocimiento se realiza mediante una señal de secreción: una secuencia corta de aminoácidos ubicada al inicio (el extremo N-terminal ) de la proteína (generalmente dentro de los primeros 20 aminoácidos), que el complejo de la aguja es capaz de reconocer. A diferencia de otros sistemas de secreción, la señal de secreción de las proteínas del sistema de secreción tipo III (T3SS) nunca se escinde de la proteína.

Inducción de la secreción

El contacto de la aguja con una célula huésped activa el sistema de secreción tipo III (T3SS); [ 14 ] no se sabe mucho sobre este mecanismo de activación (véase más adelante). La secreción también puede inducirse disminuyendo la concentración de iones de calcio en el medio de cultivo (para Yersinia y Pseudomonas ; se logra añadiendo un quelante como EDTA o EGTA ) y añadiendo el colorante aromático rojo Congo al medio de cultivo (para Shigella ), por ejemplo. Estos y otros métodos se utilizan en laboratorios para inducir artificialmente la secreción tipo III.

La inducción de la secreción por señales externas distintas al contacto con las células del huésped también ocurre in vivo , en organismos infectados. Las bacterias detectan señales como la temperatura , el pH , la osmolaridad y los niveles de oxígeno , y las utilizan para "decidir" si activar su T3SS. Por ejemplo, Salmonella puede replicarse e invadir mejor en el íleon que en el ciego del intestino animal . Las bacterias pueden saber dónde están gracias a los diferentes iones presentes en estas regiones; el íleon contiene formiato y acetato , mientras que el ciego no. Las bacterias detectan estas moléculas, determinan que están en el íleon y activan su maquinaria de secreción. Las moléculas presentes en el ciego, como el propionato y el butirato , proporcionan una señal negativa a las bacterias e inhiben la secreción. El colesterol , un lípido que se encuentra en la mayoría de las membranas celulares eucariotas, es capaz de inducir la secreción en Shigella .

Las señales externas mencionadas anteriormente regulan la secreción directamente o mediante un mecanismo genético. Se conocen varios factores de transcripción que regulan la expresión de los genes del sistema de secreción tipo III (T3SS). Algunas de las chaperonas que se unen a los efectores del T3SS también actúan como factores de transcripción. Se ha sugerido un mecanismo de retroalimentación: cuando la bacteria no secreta, sus proteínas efectoras se unen a las chaperonas y permanecen en el citoplasma. Al comenzar la secreción, las chaperonas se disocian de los efectores, que se secretan y abandonan la célula. Las chaperonas aisladas actúan entonces como factores de transcripción, uniéndose a los genes que codifican sus efectores e induciendo su transcripción, lo que conlleva la producción de más efectores.

Se ha propuesto que estructuras similares a los inyectosomas de tipo 3SS remachan las membranas internas y externas de bacterias gramnegativas para ayudar a liberar vesículas de membrana externa dirigidas a entregar secreciones bacterianas al huésped eucariota u otras células diana in vivo. [ 15 ]

Infección mediada por T3SS

Los efectores del T3SS entran en el complejo de la aguja por la base y se abren paso dentro de ella hacia la célula huésped. Se desconoce en gran medida la forma exacta en que los efectores entran en la célula huésped. Anteriormente se sugirió que la propia aguja es capaz de perforar un agujero en la membrana de la célula huésped; esta teoría ha sido refutada. Ahora está claro que algunos efectores, denominados colectivamente translocadores, se secretan primero y producen un poro o canal (un translocón) en la membrana de la célula huésped, a través del cual pueden entrar otros efectores. Las bacterias mutadas que carecen de translocadores pueden secretar proteínas, pero no pueden introducirlas en las células huésped. En general, cada T3SS incluye tres translocadores. Algunos translocadores cumplen una doble función: después de participar en la formación del poro, entran en la célula y actúan como efectores propiamente dichos .

Los efectores del sistema de secreción tipo III (T3SS) manipulan las células huésped de diversas maneras. El efecto más notable es la promoción de la captación de la bacteria por la célula huésped. Muchas bacterias que poseen T3SS deben entrar en las células huésped para replicarse y propagar la infección. Los efectores que inyectan en la célula huésped inducen a esta a engullir la bacteria y prácticamente "devorarla". Para que esto ocurra, los efectores bacterianos manipulan la maquinaria de polimerización de actina de la célula huésped. La actina es un componente del citoesqueleto y también participa en la motilidad y en los cambios de forma celular. A través de sus efectores T3SS, la bacteria puede utilizar la propia maquinaria de la célula huésped en su beneficio. Una vez que la bacteria ha entrado en la célula, puede secretar otros efectores con mayor facilidad y penetrar en las células vecinas, infectando rápidamente todo el tejido .

También se ha demostrado que los efectores del T3SS alteran el ciclo celular del huésped , y algunos de ellos son capaces de inducir apoptosis . Uno de los efectores del T3SS más estudiados es IpaB de Shigella flexneri . Cumple una doble función: como translocador, creando un poro en la membrana de la célula huésped, y como efector, ejerciendo múltiples efectos perjudiciales sobre la célula huésped. Se ha demostrado que IpaB induce apoptosis en macrófagos —células del sistema inmunitario animal— tras ser fagocitado por ellos. [ 16 ] Posteriormente se demostró que IpaB logra esto interactuando con la caspasa 1 , una importante proteína reguladora en las células eucariotas. [ 17 ]

Otra clase bien caracterizada de efectores T3SS son los efectores tipo activador de la transcripción ( efectores TAL ) de Xanthomonas . Cuando se inyectan en plantas, estas proteínas pueden entrar en el núcleo de la célula vegetal, unirse a secuencias promotoras de la planta y activar la transcripción de genes vegetales que ayudan en la infección bacteriana. [ 18 ] Recientemente se ha demostrado que el reconocimiento del ADN por el efector TAL comprende un código simple [ 19 ] [ 20 ] y esto ha mejorado enormemente la comprensión de cómo estas proteínas pueden alterar la transcripción de genes en las células de la planta huésped.

Problemas sin resolver

La topología y organización del complejo de agujas de Salmonella . [ 21 ]

Desde mediados de los años noventa se han publicado cientos de artículos sobre el sistema T3SS. Sin embargo, aún quedan numerosos problemas sin resolver:

  • Proteínas T3SS . De las aproximadamente 30 proteínas T3SS presentes en cada organismo, se han detectado directamente menos de 10 mediante métodos bioquímicos . El resto, al ser quizás raras, han resultado difíciles de detectar y siguen siendo teóricas (aunque se han realizado estudios genéticos, en lugar de bioquímicos, sobre muchos genes/proteínas T3SS). La localización de cada proteína tampoco se conoce por completo.
  • La longitud de la aguja . Se desconoce cómo la bacteria "sabe" cuándo una aguja nueva ha alcanzado su longitud adecuada. Existen varias teorías, entre ellas la existencia de una "proteína regla" que conecta de alguna manera la punta con la base de la aguja. La adición de nuevos monómeros a la punta de la aguja debería estirar la proteína regla y, por lo tanto, indicar la longitud de la aguja a la base.
  • Energética . La fuerza que impulsa el paso de las proteínas dentro de la aguja no se conoce por completo. Una ATPasa está asociada a la base del sistema de secreción tipo III (T3SS) y participa en la dirección de las proteínas hacia el interior de la aguja; sin embargo, no está claro si proporciona la energía necesaria para el transporte.
  • Señal de secreción . Como se mencionó anteriormente, se conoce la existencia de una señal de secreción en las proteínas efectoras. Esta señal permite al sistema distinguir las proteínas transportadas por el sistema de secreción tipo III (T3SS) de cualquier otra proteína. Su naturaleza, requisitos y mecanismo de reconocimiento no se comprenden del todo, pero recientemente se han desarrollado métodos para predecir qué proteínas bacterianas pueden ser transportadas por el sistema de secreción tipo III. [ 22 ]
  • Activación de la secreción . La bacteria debe saber cuándo es el momento adecuado para secretar efectores. La secreción innecesaria, cuando no hay células huésped cerca, supone un desperdicio de energía y recursos para la bacteria. La bacteria es capaz de reconocer el contacto de la aguja con la célula huésped. Aún se está investigando cómo se produce esto, y el método podría depender del patógeno. Algunas teorías postulan un delicado cambio conformacional en la estructura de la aguja al entrar en contacto con la célula huésped; este cambio quizás sirva como señal para que la base inicie la secreción. Se ha descubierto un método de reconocimiento en Salmonella , que se basa en la detección del pH citosólico de la célula huésped a través del sistema de secreción tipo III (T3SS) codificado por la isla de patogenicidad 2 para activar la secreción de efectores. [ 23 ]
  • Unión de chaperonas . Se desconoce cuándo se unen las chaperonas a sus efectores (si durante o después de la traducción ) y cómo se disocian de sus efectores antes de la secreción.
  • Mecanismos efectores . Si bien desde principios del siglo XXI se ha revelado mucho sobre las formas en que los efectores del sistema de secreción tipo III (T3SS) manipulan al huésped, la mayoría de los efectos y vías siguen siendo desconocidos.
  • Evolución . Como se mencionó, el T3SS está estrechamente relacionado con el flagelo bacteriano. [ 24 ] Hay tres hipótesis en competencia: [ 25 ] primero, que el flagelo evolucionó primero y el T3SS se deriva de esa estructura, segundo, que el T3SS evolucionó primero y el flagelo se deriva de él, y tercero, que las dos estructuras se derivan de un ancestro común. Hubo cierta controversia sobre los diferentes escenarios, [ 5 ] [ 25 ] ya que todos explican la homología de proteínas entre las dos estructuras, así como su diversidad funcional. [ 26 ] Sin embargo, evidencia filogenómica reciente favorece la hipótesis de que el T3SS se derivó del flagelo por un proceso que involucra pérdida de genes inicial y luego adquisición de genes. [ 27 ] Un paso clave de este último proceso fue el reclutamiento de secretinas al T3SS, un evento que ocurrió al menos tres veces a partir de otros sistemas asociados a la membrana.

Nomenclatura de las proteínas T3SS

Flagelo de bacterias Gram negativas. Los anillos de la base son muy similares a los anillos del complejo de la aguja, aunque no se ha demostrado la existencia de un anillo C en dicho complejo. El gancho flagelar es homólogo a la aguja del sistema de secreción tipo III (T3SS).

Desde principios de la década de 1990, se han descubierto nuevas proteínas T3SS en diferentes especies bacterianas a un ritmo constante. Se han asignado abreviaturas de forma independiente a cada serie de proteínas en cada organismo, y los nombres generalmente no revelan mucho sobre la función de la proteína. Algunas proteínas descubiertas independientemente en diferentes bacterias han demostrado ser homólogas ; sin embargo, en su mayoría se han conservado los nombres históricos, lo que podría generar confusión. Por ejemplo, las proteínas SicA, IpgC y SycD son homólogas de Salmonella , Shigella y Yersinia , respectivamente, pero la última letra (el "número de serie") de su nombre no lo indica.

A continuación se presenta un resumen de los nombres de series de proteínas más comunes en varias especies que contienen el sistema de secreción tipo III (T3SS). Cabe destacar que estos nombres incluyen tanto las proteínas que forman la maquinaria del T3SS como las proteínas efectoras secretadas :

  • Yersinia
    • Yop : proteína externa de Yersinia
    • Ysc : Secreción de Yersinia (componente)
    • Ypk : proteína quinasa de Yersinia
  • Salmonela
    • Spa : Presentación superficial del antígeno
    • Sic : chaperona de invasión de Salmonella
    • Sip : Proteína de invasión de Salmonella
    • Prg : gen reprimido por PhoP
    • Inv : Invasión
    • Org : Gen regulado por oxígeno
    • Ssp : proteína secretada por Salmonella
    • Iag : gen asociado a la invasión
  • Shigella
    • Ipg : gen del plásmido de invasión
    • Ipa : antígeno del plásmido de invasión
    • Mxi : Expresión de membrana de Ipa
    • Spa : Presentación superficial del antígeno
    • Osp : Proteína externa de Shigella
  • Escherichia
    • Tir : Receptor de intimina translocado
    • Septiembre : Secreción de proteínas de E. coli
    • Esc : Secreción de Escherichia (componente)
    • Esp : proteína de secreción de Escherichia
    • Ces : Chaperona de la secreción de E. coli
  • Pseudomonas
    • Hrp : Respuesta hipersensible y patogenicidad
    • Hrc : Respuesta hipersensible conservada (o Hrp conservada)
  • Rhizobium
    • Nop : Proteína de nodulación
    • Rhc : Rhizobium conservado
  • En varias especies:
    • Vir : Virulencia
  • "Protochlamydia amoebophila"
  • "Sodalis glossinidius" [ 28 ]

Tras estas abreviaturas, aparece una letra o un número. Las letras suelen indicar un número de serie, ya sea el orden cronológico de descubrimiento o el orden físico de aparición del gen en un operón . Los números, menos frecuentes, indican el peso molecular de la proteína en kDa . Ejemplos: IpaA, IpaB, IpaC; MxiH, MxiG, MxiM; Spa9, Spa47.

En todos los sistemas de secreción tipo III (T3SS) aparecen varios elementos clave: el monómero de la aguja, la varilla interna de la aguja, las proteínas del anillo, los dos translocadores, la proteína de la punta de la aguja, la proteína reguladora (que se cree que determina la longitud de la aguja; véase más arriba) y la ATPasa , que proporciona energía para la secreción. La siguiente tabla muestra algunas de estas proteínas clave en cuatro bacterias que contienen T3SS:

Métodos empleados en la investigación del sistema de secreción tipo III (T3SS)

Aislamiento de complejos de agujas del sistema de secreción tipo III (T3SS)

El aislamiento de estructuras de membrana grandes, frágiles e hidrofóbicas de las células ha representado un desafío durante muchos años. Sin embargo, a finales de la década de 1990, se desarrollaron varios métodos para el aislamiento de los NC del T3SS. En 1998, se aislaron los primeros NC de Salmonella typhimurium . [ 29 ]

Para el aislamiento, las bacterias se cultivan en un gran volumen de medio de cultivo líquido hasta que alcanzan la fase logarítmica . Luego se centrifugan ; el sobrenadante (el medio) se desecha y el sedimento (las bacterias) se resuspende en un tampón de lisis que generalmente contiene lisozima y, a veces, un detergente como LDAO o Triton X-100 . Este tampón desintegra la pared celular . Después de varias rondas de lisis y lavado, las bacterias abiertas se someten a una serie de ultracentrifugaciones . Este tratamiento enriquece las estructuras macromoleculares grandes y descarta los componentes celulares más pequeños. Opcionalmente, el lisado final se somete a una purificación adicional mediante gradiente de densidad de CsCl .

Un método adicional para una mayor purificación utiliza cromatografía de afinidad . Las proteínas recombinantes del sistema de secreción tipo III (T3SS) que portan una etiqueta proteica (por ejemplo, una etiqueta de histidina ) se producen mediante clonación molecular y luego se introducen ( transforman ) en las bacterias estudiadas. Tras el aislamiento inicial de la nanocavidad, como se describió anteriormente, el lisado se pasa a través de una columna recubierta con partículas de alta afinidad por la etiqueta (en el caso de las etiquetas de histidina: iones de níquel ). La proteína marcada queda retenida en la columna, junto con todo el complejo de la nanocavidad. Mediante estos métodos se pueden alcanzar altos grados de pureza. Esta pureza es esencial para muchos ensayos delicados que se han utilizado para la caracterización de la nanocavidad.

Los efectores de tipo III se conocían desde principios de la década de 1990, pero la forma en que se introducen en las células huésped era un completo misterio. La homología entre muchas proteínas flagelares y del sistema de secreción tipo III (T3SS) llevó a los investigadores a sospechar la existencia de una estructura externa del T3SS similar a los flagelos. La identificación y posterior aislamiento de la estructura en forma de aguja permitió a los investigadores:

  • caracterizar en detalle la estructura tridimensional de la NC y, a través de ello, extraer conclusiones sobre el mecanismo de secreción (por ejemplo, que el ancho estrecho de la aguja requiere el despliegue de efectores antes de la secreción),
  • analizar los componentes proteicos de la NC, sometiendo agujas aisladas a análisis proteómico (ver más abajo),
  • Se asignan funciones a los distintos componentes de la NC, para ello mediante la inactivación de los genes del sistema de secreción tipo III (T3SS), el aislamiento de las NC de las bacterias mutadas y el examen de los cambios provocados por las mutaciones.

Microscopía, cristalografía y RMN de estado sólido

Como ocurre con casi todas las proteínas, la visualización de los NC del T3SS solo es posible con microscopía electrónica . Las primeras imágenes de NC (1998) mostraron estructuras en forma de aguja que sobresalían de la pared celular de bacterias vivas y NC aislados planos y bidimensionales. [ 29 ] En 2001, se analizaron digitalmente imágenes de NC de Shigella flexneri y se promediaron para obtener una primera estructura semi-3D del NC. [ 8 ] La estructura helicoidal de los NC de Shigella flexneri se resolvió a una resolución de 16 Å utilizando difracción de rayos X en fibras en 2003, [ 30 ] y un año después se publicó una estructura 3D de 17 Å de los NC de Salmonella typhimurium . [ 31 ] Los avances y enfoques recientes han permitido obtener imágenes 3D de alta resolución del NC, [ 32 ] [ 33 ] aclarando aún más la compleja estructura del NC.

Numerosas proteínas del sistema de secreción tipo III (T3SS) se han cristalizado a lo largo de los años. Estas incluyen proteínas estructurales del complejo de la aguja, efectores y chaperonas. La primera estructura de un monómero del complejo de la aguja fue la estructura por RMN de BsaL de "Burkholderia pseudomallei" y, posteriormente, la estructura cristalina de MixH de Shigella flexneri , ambas resueltas en 2006. [ 34 ] [ 35 ]

En 2012, una combinación de producción de agujas recombinantes de tipo silvestre, RMN de estado sólido , microscopía electrónica [ 36 ] y modelado Rosetta reveló las interfaces supramoleculares y, en última instancia, la estructura atómica completa de la aguja del T3SS de Salmonella typhimurium . [ 37 ] Se demostró que las subunidades PrgI de 80 residuos forman un ensamblaje helicoidal dextrógiro con aproximadamente 11 subunidades por cada dos vueltas, similar al del flagelo de Salmonella typhimurium . El modelo también reveló un dominio amino-terminal extendido que se posiciona en la superficie de la aguja, mientras que el extremo carboxilo altamente conservado apunta hacia el lumen. [ 37 ]

Proteómica

Se han empleado varios métodos para identificar el conjunto de proteínas que componen el T3SS. Los complejos de aguja aislados pueden separarse mediante SDS-PAGE . Las bandas que aparecen tras la tinción pueden extraerse individualmente del gel y analizarse mediante secuenciación de proteínas y espectrometría de masas . Los componentes estructurales del NC pueden separarse entre sí (por ejemplo, la parte de la aguja de la parte de la base) y, analizando esas fracciones, se pueden deducir las proteínas que participan en cada una. Alternativamente, los NC aislados pueden analizarse directamente mediante espectrometría de masas, sin electroforesis previa , para obtener una imagen completa del proteoma del NC .

Estudios genéticos y funcionales

El sistema de secreción tipo III (T3SS) de muchas bacterias ha sido manipulado por investigadores. Observar la influencia de cada manipulación puede utilizarse para comprender mejor la función de cada componente del sistema. Algunos ejemplos de manipulaciones son:

  • Eliminación de uno o más genes T3SS ( eliminación genética ).
  • Sobreexpresión de uno o más genes del sistema de secreción tipo III (T3SS) (en otras palabras: producción in vivo de una proteína del T3SS en cantidades mayores de lo habitual).
  • Cambios puntuales o regionales en los genes o proteínas del sistema de secreción tipo III (T3SS). Esto se realiza para definir la función de aminoácidos o regiones específicas en una proteína.
  • La introducción de un gen o una proteína de una especie de bacteria en otra (ensayo de complementación cruzada). Esto se realiza para comprobar las diferencias y similitudes entre dos sistemas de secreción tipo III (T3SS).

La manipulación de los componentes del sistema de secreción tipo III (T3SS) puede influir en diversos aspectos de la función y la patogenicidad bacterianas. Ejemplos de posibles influencias:

  • La capacidad de las bacterias para invadir las células del huésped, en el caso de patógenos intracelulares. Esto se puede medir mediante un ensayo de invasión ( ensayo de protección con gentamicina ).
  • La capacidad de las bacterias intracelulares para migrar entre las células del huésped.
  • La capacidad de las bacterias para matar células huésped. Esto se puede medir mediante varios métodos, por ejemplo, mediante el ensayo de liberación de LDH , en el que se identifica la enzima LDH, que se libera de las células muertas, midiendo su actividad enzimática.
  • La capacidad de un sistema de secreción tipo III (T3SS) para secretar una proteína específica o para secretar cualquier proteína. Para evaluar esto, se induce la secreción en bacterias que crecen en un medio líquido. Posteriormente, las bacterias y el medio se separan por centrifugación, y la fracción del medio (el sobrenadante) se analiza para detectar la presencia de proteínas secretadas. Para evitar que una proteína que normalmente se secreta se libere, se le puede unir artificialmente una molécula grande. Si la proteína que no se secreta queda "atascada" en la base del complejo de la aguja, la secreción se bloquea eficazmente.
  • La capacidad de las bacterias para ensamblar un complejo de agujas intacto. Los complejos de agujas pueden aislarse de bacterias manipuladas y examinarse al microscopio. Sin embargo, los cambios menores no siempre se detectan mediante microscopía.
  • La capacidad de las bacterias para infectar animales o plantas vivos. Aunque se demuestre in vitro que las bacterias manipuladas pueden infectar células huésped, no se puede dar por sentado que tengan la capacidad de mantener una infección en un organismo vivo.
  • Los niveles de expresión de otros genes. Esto se puede analizar de varias maneras, en particular mediante Northern blot y RT-PCR . Los niveles de expresión de todo el genoma se pueden analizar mediante microarrays . Muchos factores de transcripción de tipo III y redes reguladoras se descubrieron utilizando estos métodos.
  • El crecimiento y la aptitud de las bacterias.

Inhibidores del sistema de secreción tipo III (T3SS)

Se han descubierto algunos compuestos que inhiben el T3SS en bacterias gramnegativas , incluidas las guadinaminas que son producidas naturalmente por especies de Streptomyces . [ 38 ] También se han desarrollado anticuerpos monoclonales que inhiben el T3SS. [ 39 ] Se ha demostrado que Aurodox , un antibiótico capaz de inhibir la traducción de proteínas del T3SS, puede prevenir los efectores del T3SS in vitro y en modelos animales. [ 40 ] [ 41 ]

Herramientas de predicción de péptidos señal de tipo III

  • EfectivoT3

Referencias

  1. ↑ Lara-Tejero M, Galán JE (marzo de 2019). "El Injectisome, una nanomáquina compleja para la inyección de proteínas en células de mamíferos" . EcoSal Plus . 8 (2). doi : 10.1128/ecosalplus.ESP-0039-2018 . PMC 6450406. PMID 30942149 .  
  2. ↑ McHugh RE, O'Boyle N, Connolly JP, Hoskisson PA, Roe AJ (febrero de 2019). "Caracterización del modo de acción de Aurodox, un inhibidor del sistema de secreción tipo III de Streptomyces goldiniensis" . Infection and Immunity . 87 (2): e00595–18. doi : 10.1128/IAI.00595-18 . PMC 6346137. PMID 30455200 .  
  3. ↑ Halte M, Erhardt M (enero de 2021). "Exportación de proteínas a través del sistema de secreción de tipo III del flagelo bacteriano" . Biomolecules . 11 (2): 186. doi : 10.3390/biom11020186 . PMC 7911332. PMID 33572887 .  
  4. ↑ Salmond GP, Reeves PJ (enero de 1993). "Guardianes del tráfico de membrana y secreción de proteínas en bacterias gramnegativas". Trends in Biochemical Sciences . 18 (1): 7– 12. doi : 10.1016/0968-0004(93)90080-7 . PMID 8438237 . 
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Lecturas adicionales

  • Información práctica que describe la química del inyectosoma, cortesía de la Royal Society of Chemistry.
  • Interacción huésped-patógeno en Pseudomonas syringae pv. tomato y la planta de tomate que conduce a la enfermedad de la mancha bacteriana.
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