Purificación por afinidad en tándem

La purificación por afinidad en tándem ( TAP ) es una técnica de purificación basada en inmunoprecipitación para el estudio de interacciones proteína-proteína . Su objetivo es extraer de la célula únicamente la proteína de interés, junto con cualquier otra proteína con la que haya interactuado. La TAP utiliza dos tipos de microesferas de agarosa que se unen a la proteína de interés y que pueden separarse del lisado celular mediante centrifugación, sin alterar, desnaturalizar ni contaminar los complejos implicados. Para que la proteína de interés se una a las microesferas, se le añade una etiqueta específica, la etiqueta TAP.

El método TAP original implica la fusión de la etiqueta TAP al extremo C-terminal de la proteína en estudio. La etiqueta TAP consta de tres componentes: un péptido de unión a calmodulina (CBP), un sitio de escisión de la proteasa TEV y dos dominios de proteína A , que se unen fuertemente a la IgG (lo que convierte a la etiqueta TAP en un tipo de etiqueta de epítopo ). ^{[ 1 ]}

Desde que se publicó por primera vez el principio TAP, se han propuesto muchas otras combinaciones de etiquetas, microesferas y eluyentes.

Esta etiqueta también se conoce como etiqueta TAP de extremo C, ya que existe una versión de extremo N. Sin embargo, el método que se describe a continuación presupone el uso de una etiqueta de extremo C, aunque el principio subyacente sigue siendo el mismo.

El etiquetado TAP fue inventado por un equipo de investigación que trabajaba en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular a finales de la década de 1990 (Rigaut et al., 1999, ^{[ 2 ]} Puig et al., 2001 ^{[ 3 ]} ) y se propuso como una nueva herramienta para la exploración del proteoma. Fue utilizado por el equipo para caracterizar varios complejos proteicos (Rigaut et al., 1999, ^{[ 2 ]} Caspary et al. 1999, ^{[ 4 ]} Bouveret et al., 2000, ^{[ 5 ]} Puig et al., 2001 ^{[ 3 ]} ). La primera aplicación a gran escala de esta técnica fue en 2002, en la que el equipo de investigación trabajó en colaboración con científicos de la empresa de proteómica Cellzome para desarrollar un mapa visual de la interacción de más de 230 complejos multiproteicos en una célula de levadura mediante el etiquetado sistemático de la etiqueta TAP a cada proteína. El primer informe exitoso del uso de la tecnología de etiquetas TAP en plantas se produjo en 2004 (Rohila et al., 2004, ^{[ 6 ]} ).

Existen varios métodos para introducir la proteína de fusión en las células huésped. Si el huésped es levadura , uno de los métodos puede ser el uso de plásmidos que, posteriormente, traducirán la proteína de fusión dentro del huésped. Independientemente del método empleado, es preferible mantener la expresión de la proteína de fusión lo más cerca posible de su nivel natural. Una vez traducida dentro del huésped, la proteína de fusión interactuará con otras proteínas, idealmente de una manera que no se vea afectada por la etiqueta TAP.

Posteriormente, la proteína marcada (junto con sus proteínas asociadas) se recupera mediante un proceso de selección por afinidad .

El primer tipo de microesfera que se añade está recubierta con inmunoglobulina G , que se une al extremo más externo de la etiqueta TAP. Las microesferas, junto con las proteínas de interés, se separan del lisado mediante centrifugación. A continuación, las proteínas se liberan de las microesferas mediante una enzima ( proteasa TEV ) que rompe la etiqueta en el sitio de escisión TEV central.

Tras esta primera etapa de purificación, se añade un segundo tipo de microesfera (recubierta con calmodulina ) a las proteínas liberadas, la cual se une reversiblemente al fragmento restante de la etiqueta TAP que aún permanece en las proteínas. Las microesferas se separan nuevamente mediante centrifugación, eliminando así los contaminantes y la proteasa TEV. ^{[ 3 ]} Finalmente, las microesferas se liberan con EGTA , dejando el eluido nativo que contiene únicamente la proteína de interés, sus proteínas asociadas y el fragmento CBP restante de la etiqueta TAP.

El eluato nativo puede analizarse posteriormente mediante electroforesis en gel y espectrometría de masas para identificar las proteínas con las que interactúa.

Una ventaja de este método es que permite la determinación cuantitativa in vivo de las proteínas asociadas sin conocimiento previo de su composición compleja. Además, es sencillo de ejecutar y suele ofrecer un alto rendimiento. ^{[ 3 ]} Uno de los obstáculos para el estudio de la interacción proteína-proteína es la contaminación de la proteína diana, especialmente cuando se desconoce su composición. La TAP ofrece un método eficaz y altamente específico para purificar la proteína diana. Tras dos purificaciones por afinidad sucesivas, la probabilidad de que queden contaminantes en el eluido se reduce significativamente.

Sin embargo, también existe la posibilidad de que una etiqueta añadida a una proteína dificulte la unión de la nueva proteína a sus proteínas interactuantes. Además, la etiqueta podría afectar los niveles de expresión proteica. Por otro lado, la etiqueta también podría no estar suficientemente expuesta a las microesferas de afinidad, lo que distorsionaría los resultados.

También puede existir la posibilidad de una escisión de las proteínas por la proteasa TEV , aunque es poco probable que esto sea frecuente dada la alta especificidad de la proteasa TEV. ^{[ 7 ]}

Dado que este método requiere al menos dos lavados, puede que no sea adecuado para analizar interacciones proteicas transitorias , a diferencia del método de doble híbrido de levadura o la reticulación in vivo con análogos de aminoácidos fotorreactivos . Sin embargo, es un buen método para evaluar interacciones proteicas estables y permite distintos grados de investigación controlando el número de veces que se purifica el complejo proteico.

En 2002, la etiqueta TAP se utilizó por primera vez con espectrometría de masas en un enfoque a gran escala para analizar sistemáticamente la proteómica de la levadura mediante la caracterización de complejos multiproteicos. ^{[ 8 ]} El estudio reveló 491 complejos, 257 de ellos completamente nuevos. El resto eran conocidos por otras investigaciones, pero ahora se descubrió que prácticamente todos tenían nuevos componentes. Elaboraron un mapa que relacionaba funcionalmente todos los componentes proteicos en una red compleja.

Muchos otros análisis proteómicos también implican el uso de la etiqueta TAP. Una investigación de EMBO (Dziembowski, 2004) identificó un nuevo complejo necesario para la retención y el empalme del pre-ARNm nuclear. Han purificado un nuevo complejo trimérico compuesto por otras 3 subunidades (Snu17p, Bud13p y Pml1p) y encontraron que estas subunidades no son esenciales para la viabilidad pero sí necesarias para el empalme eficiente (eliminación de intrones) del pre-ARNm. En 2006, Fleischer et al. identificaron sistemáticamente proteínas asociadas con complejos ribosomales eucariotas. ^{[ 9 ]} Utilizaron cribados proteómicos de espectrometría de masas multifacéticos para identificar complejos ribosomales de levadura y luego utilizaron el etiquetado TAP para vincular funcionalmente todas estas proteínas.

El principio de purificación por afinidad en tándem de complejos multiproteicos no se limita a la combinación de etiquetas CBP y Proteína A utilizada en el trabajo original de Rigaut et al. (1999). Por ejemplo, la combinación de etiquetas FLAG y HA ha sido utilizada desde el año 2000 por el grupo de Nakatani ^{[ 10 ] [ 11 ]} para purificar numerosos complejos proteicos de células de mamíferos. Se han propuesto muchas otras combinaciones de etiquetas desde la publicación del principio TAP.

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