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TILLING (biología molecular)

TILLING ( Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) es un método de biología molecular que permite la identificación dirigida de mutaciones en un gen específico . TILLING se ...

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TILLING ( Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) es un método de biología molecular que permite la identificación dirigida de mutaciones en un gen específico . TILLING se introdujo en el año 2000, utilizando la planta modelo Arabidopsis thaliana , y un pequeño grupo de científicos, entre ellos Luca Comai , lo amplió a otros usos y metodologías . Desde entonces, TILLING se ha utilizado como método de genética inversa en otros organismos como el pez cebra , el maíz , el trigo , el arroz , la soja , el tomate y la lechuga .

Descripción general

El método combina una técnica estándar y eficiente de mutagénesis mediante un mutágeno químico como el metanosulfonato de etilo (EMS) con una técnica sensible de cribado de ADN que identifica mutaciones puntuales (de una sola base) en un gen diana. El método TILLING se basa en la formación de heterodúplex de ADN que se generan al amplificar múltiples alelos mediante PCR , los cuales se calientan y enfrían lentamente. Se forma una burbuja en el punto de desajuste de las dos hebras de ADN, la cual es posteriormente escindida por una nucleasa de cadena simple . Los productos se separan por tamaño en diversas plataformas (véase más abajo).

Las discrepancias pueden deberse a mutaciones inducidas, heterocigosidad dentro de un individuo o variación natural entre individuos.

EcoTILLING [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] es un método que utiliza técnicas TILLING para buscar mutaciones naturales en individuos, generalmente para análisis de genética de poblaciones. DECOTILLING [ 5 ] es una modificación de TILLING y EcoTILLING que utiliza un método económico para identificar fragmentos. Desde la llegada de las tecnologías de secuenciación NGS , se ha desarrollado TILLING-by-sequencing [ 6 ] basado en la secuenciación Illumina de genes diana amplificados a partir de plantillas agrupadas multidimensionalmente para identificar posibles cambios de un solo nucleótido.

Enzimas de escisión de cadena simple

Existen varias fuentes de nucleasas de cadena simple. La primera enzima ampliamente utilizada fue la nucleasa de frijol mungo , pero se ha demostrado que esta nucleasa tiene una alta actividad no específica y solo funciona a pH bajo, lo que puede degradar los productos de PCR y los cebadores marcados con colorante. La fuente original de nucleasa de cadena simple fue CEL1, o CJE (extracto de jugo de apio), pero otros productos han entrado en el mercado, incluidas las enzimas SNiPerase de Frontier Genomics, que han sido optimizadas para su uso en plataformas que utilizan productos de PCR marcados y no marcados (ver la siguiente sección). Transgenomic aisló la proteína nucleasa de cadena simple y la vende como una forma recombinante. La ventaja de la forma recombinante es que, a diferencia de las mezclas de enzimas, no contiene actividad nucleasa no específica, que puede degradar los colorantes en los cebadores de PCR. La desventaja es un costo sustancialmente más alto.

Separación de los productos de escisión

El primer artículo que describió TILLING utilizó HPLC para identificar mutaciones (McCallum et al., 2000a). El método se hizo más eficiente mediante el uso de la enzima de restricción Cel-I combinada con el sistema basado en gel LICOR para identificar mutaciones (Colbert et al., 2001). Las ventajas de usar este sistema son que los sitios de mutación se pueden confirmar fácilmente y diferenciar del ruido. Esto se debe a que se pueden usar diferentes colorantes para los cebadores directo e inverso. Una vez que los productos de clivaje se han corrido en un gel, se pueden ver en canales separados y, al igual que en un RFLP, los tamaños de los fragmentos dentro de una calle en cada canal deben sumar el tamaño del producto de longitud completa. Las ventajas del sistema LICOR son la separación de fragmentos grandes (~2 kb), el alto rendimiento de muestras (96 muestras cargadas en peines de papel) y el software gratuito para identificar las mutaciones (GelBuddy). Las desventajas del sistema LICOR son tener que verter geles de placa y tiempos de ejecución prolongados (~4 horas). Los métodos TILLING y EcoTILLING se están utilizando actualmente en sistemas capilares de Advanced Analytical Technologies, ABI y Beckman.

Se pueden utilizar varios sistemas para separar productos de PCR que no están marcados con colorantes. Los sistemas simples de electroforesis en agarosa separan los productos de clivaje de forma económica y con equipo de laboratorio estándar. Este método se utilizó para descubrir SNP en salmón chum y se denominó DECOTILLING. La desventaja de este sistema es la menor resolución en comparación con los sistemas de poliacrilamida. Elchrom Scientific vende geles Spreadex, que son prefabricados, permiten un alto rendimiento y son más sensibles que los geles de poliacrilamida estándar. Advanced Analytical Technologies Inc. vende el sistema fluorescente AdvanCE FS96 dsDNA, un sistema de electroforesis capilar de 96 capilares que presenta varias ventajas sobre los métodos tradicionales; entre ellas, la capacidad de separar fragmentos grandes (hasta 40 kb), la ausencia de pasos de desalación o precipitación, tiempos de ejecución cortos (~30 minutos), sensibilidad de hasta 5 pg/µl y la ausencia de necesidad de cebadores marcados con fluorescencia.

centros de alicatado

En todo el mundo existen varios centros TILLING que se centran en especies de importancia agrícola:

  • Rice – UC Davis (EE. UU.)
  • Maíz – Universidad de Purdue (EE. UU.)
  • Brassica napus – Universidad de Columbia Británica (CA)
  • Brassica rapa – Centro John Innes (Reino Unido)
  • Arabidopsis – Investigación del Cáncer Fred Hutchinson
  • Soja – Universidad del Sur de Illinois (EE. UU.)
  • Lotus y Medicago – Centro John Innes (Reino Unido)
  • Trigo – UC Davis (EE. UU.)
  • Guisante, tomate - INRA (Francia)
  • Tomate - RTGR, Universidad de Hyderabad (India)

Referencias

  1. ↑ Comai, L. ; Young, K.; Till, BJ; Reynolds, SH; Greene, EA; Codomo, CA; Enns, LC; Johnson, JE; Burtner, C.; Odden, AR; Henikoff, S. (2004). "Descubrimiento eficiente de polimorfismos de ADN en poblaciones naturales mediante Ecotilling". The Plant Journal . 37 (5): 778– 786. doi : 10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x . PMID 14871304 . 
  2. ↑ Gilchrist, EJ; Haughn, GW; Ying, CC; Otto, SP; Zhuang, J.; Cheung, D.; Hamberger, B.; Aboutorabi, F.; Kalynyak, T.; Johnson, LEE; Bohlmann, J.; Ellis, BE; Douglas, CJ; Cronk, QCB (2006). "Uso de la labranza ecológica como una herramienta eficiente para el descubrimiento de SNP para estudiar la variación genética en poblaciones silvestres de Populus trichocarpa". Molecular Ecology . 15 (5): 1367– 1378. Bibcode : 2006MolEc..15.1367G . doi : 10.1111/j.1365-294X.2006.02885.x . PMID 16626459 . S2CID 16198260 .  
  3. ↑ Mejlhede, N.; Kyjovska, Z.; Backes, G.; Burhenne, K.; Rasmussen, SK; Jahoor, A. (2006). "EcoTILLING para la identificación de variación alélica en los genes de resistencia al oídio mlo y Mla de la cebada" (PDF) . Mejora de plantas . 125 (5): 461– 467. Bibcode : 2006PBree.125..461M . doi : 10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x . S2CID 62901355 . 
  4. ↑ Nieto, C.; Pirón, F.; Dalmais, M.; Marco, CF; Moriones, E.; Gómez-Guillamón, ML; Truniger, V.; Gómez, P.; García-Más, J.; Aranda, MA; Bendahmane, A. (2007). «EcoTILLING para la identificación de variantes alélicas de melón eIF4E, factor que controla la susceptibilidad a virus» . Biología vegetal BMC . 7 (1) 34. Código Bib : 2007BMCPB...7...34N . doi : 10.1186/1471-2229-7-34 . PMC 1914064 . PMID 17584936 .  
  5. ↑ Garvin, MR; Gharrett, AJ (2007). "DEco-TILLING: Un método económico para el descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido que reduce el sesgo de detección". Molecular Ecology Notes . 7 (5): 735– 746. doi : 10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x .
  6. ↑ Tsai, Helen; Howell, Tyson; Nitcher, Rebecca; Missirian, Victor; Watson, Brian; Ngo, Kathie J.; Lieberman, Meric; Fass, Joseph; Uauy, Cristobal; Tran, Robert K.; Khan, Asif Ali; Filkov, Vladimir; Tai, Thomas H.; Dubcovsky, Jorge; Comai, Luca (2011). "Descubrimiento de mutaciones raras en poblaciones: TILLING mediante secuenciación" . Plant Physiology . 156 (3): 1257– 1268. doi : 10.1104/pp.110.169748 . PMC 3135940. PMID 21531898 .  

Literatura científica

  • Colbert, T; Till, BJ; Tompa, R; Reynolds, S; Steine, MN; Yeung, AT; McCallum, CM; Comai, L ; Henikoff, S (junio de 2001). "Cribado de alto rendimiento para mutaciones puntuales inducidas" . Plant Physiol . 126 (2): 480–4 . doi : 10.1104/pp.126.2.480 . PMC 1540114. PMID 11402178 .  
  • Draper, BW; McCallum, CM; Stout, JL; Slade, AJ; Moens, CB (2004). "Un método de alto rendimiento para identificar mutaciones puntuales inducidas por N-etil-N-nitrosourea (ENU) en el pez cebra". El pez cebra: genética, genómica e informática . Métodos en biología celular. Vol.  77. págs. 91–112 . doi : 10.1016/s0091-679x(04)77005-3 . ISBN  9780125641722. PMID 15602907 . {{cite book}}: |journal=ignorado ( ayuda )
  • McCallum, CM; Comai, L ; Greene, EA; Henikoff, S (abril de 2000). "Detección dirigida de mutaciones inducidas". Nat Biotechnol . 18 (4): 455–7 . doi : 10.1038/74542 . PMID 10748531. S2CID 12063367 .  
  • McCallum, CM; Comai, L ; Greene, EA; Henikoff, S (junio de 2000). "Dirigiendo lesiones locales inducidas en genomas (TILLING) para la genómica funcional de plantas" . Plant Physiol . 123 (2): 439–42 . doi : 10.1104/pp.123.2.439 . PMC 1539256. PMID 10859174 .  
  • Slade, AJ; Fuerstenberg, SI; Loeffler, D; Steine, MN; Facciotti, D (enero de 2005). "Un enfoque genético inverso, no transgénico, para la mejora del cultivo de trigo mediante TILLING". Nat Biotechnol . 23 (1): 75–81 . doi : 10.1038/nbt1043 . PMID 15580263. S2CID 12109468 .  
  • El proyecto de cultivo de Arabidopsis
  • Introducción al cultivo de la tierra
  • Proyecto TILLING de pez cebra
  • Proyecto de mutación de pez cebra del Instituto Sanger