Subclonación

En biología molecular , la subclonación es una técnica que se utiliza para transferir una secuencia de ADN específica de un vector parental a un vector de destino .

La subclonación no debe confundirse con la clonación molecular , una técnica relacionada.

Las enzimas de restricción se utilizan para escindir el gen de interés (el inserto ) del ADN parental. El inserto se purifica para aislarlo de otras moléculas de ADN. Un método de purificación común es el aislamiento en gel . Posteriormente, se amplifica el número de copias del gen mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Simultáneamente, se utilizan las mismas enzimas de restricción para digerir (cortar) el vector de destino. El objetivo de usar las mismas enzimas de restricción es crear extremos cohesivos complementarios , lo que facilitará la ligación posterior. También se añade una fosfatasa , comúnmente fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), para prevenir la autoligación del vector de destino. El vector de destino digerido se aísla/purifica.

El inserto y el vector de destino se mezclan con la ADN ligasa. Una proporción molar típica de genes insertados a vectores de destino es de 3:1; ^{[ 1 ]} al aumentar la concentración del inserto, la autoligación disminuye aún más. Después de dejar reposar la mezcla de reacción durante un tiempo determinado a una temperatura específica (que depende del tamaño de las hebras que se ligan; para más información, véase ADN ligasa ), el inserto debería incorporarse con éxito al plásmido de destino .

El plásmido se suele introducir en una bacteria como E. coli . Idealmente, cuando la bacteria se divide, el plásmido también debería replicarse. En el mejor de los casos, cada célula bacteriana debería tener varias copias del plásmido. Una vez que se ha desarrollado un buen número de colonias bacterianas, se pueden preparar mediante minipreparación para extraer el ADN del plásmido.

Para asegurar el crecimiento exclusivo de bacterias transformadas (que portan los plásmidos deseados), se utiliza un gen marcador en el vector de destino para la selección . Los genes marcadores típicos son para la resistencia a antibióticos o la biosíntesis de nutrientes . Por ejemplo, el gen marcador podría conferir resistencia al antibiótico ampicilina. Si las bacterias que debían incorporar el plásmido deseado lo hubieran hecho, también contendrían el gen marcador. De esta manera, las bacterias que incorporaron el plásmido podrían crecer en presencia de ampicilina, mientras que las que no lo incorporaron seguirían siendo vulnerables a su destrucción. Por lo tanto, se seleccionarían las bacterias transformadas con éxito.

En este ejemplo, un gen de una biblioteca genética de mamíferos se subclonará en un plásmido bacteriano (plataforma de destino). El plásmido bacteriano es un fragmento de ADN circular que contiene elementos reguladores que permiten a la bacteria producir un producto génico ( expresión génica ) si se coloca en el lugar correcto del plásmido. El sitio de producción está flanqueado por dos sitios de corte de enzimas de restricción, "A" y "B", con extremos cohesivos incompatibles.

El ADN de los mamíferos no contiene estos sitios de restricción, por lo que se insertan mediante PCR de extensión por solapamiento . Los cebadores están diseñados para ubicar los sitios de restricción con precisión, de modo que la codificación de la proteína se mantenga en fase y se inserte un mínimo de aminoácidos adicionales a cada lado de la proteína.

Tanto el producto de PCR que contiene el gen de mamífero con los nuevos sitios de restricción como el plásmido de destino se someten a digestión con enzimas de restricción, y los productos de la digestión se purifican mediante electroforesis en gel .

Los productos de la digestión, que ahora contienen extremos cohesivos compatibles entre sí (pero extremos cohesivos incompatibles consigo mismos), se someten a ligación, creando un nuevo plásmido que contiene los elementos de fondo del plásmido original con un inserto diferente.

El plásmido se introduce en bacterias y la identidad del inserto se confirma mediante secuenciación de ADN .

• Clonación
• Clonación molecular
• reacción en cadena de la polimerasa
• clonación TA