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Validación de la estructura

Concepto de validación de estructura: modelo de una proteína (cada esfera es un átomo) y región ampliada con datos de densidad electrónica y 3 indicadores brillantes para proble...

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Concepto de validación de estructura: modelo de una proteína (cada esfera es un átomo) y región ampliada con datos de densidad electrónica y 3 indicadores brillantes para problemas.

La validación de la estructura macromolecular es el proceso de evaluar la fiabilidad de los modelos atómicos tridimensionales de grandes moléculas biológicas, como proteínas y ácidos nucleicos . Estos modelos, que proporcionan coordenadas 3D para cada átomo de la molécula (véase el ejemplo en la imagen), provienen de experimentos de biología estructural, como la cristalografía de rayos X [ 1 ] o la resonancia magnética nuclear (RMN) [ 2 ] . La validación tiene tres aspectos: 1) comprobar la validez de los miles o millones de mediciones del experimento; 2) comprobar la coherencia del modelo atómico con esos datos experimentales; y 3) comprobar la coherencia del modelo con las propiedades físicas y químicas conocidas.

Las proteínas y los ácidos nucleicos son fundamentales para la biología, ya que permiten las reacciones químicas, la organización estructural, el crecimiento, la movilidad, la reproducción y la sensibilidad ambiental necesarias. Para sus funciones biológicas, son esenciales las estructuras tridimensionales detalladas de las moléculas y los cambios que se producen en ellas. Para comprender y controlar estas funciones, necesitamos un conocimiento preciso de los modelos que representan dichas estructuras, incluyendo sus numerosas ventajas y sus ocasionales limitaciones.

Entre los usuarios finales de los modelos macromoleculares se incluyen médicos, docentes y estudiantes, así como los propios biólogos estructurales, editores y revisores de revistas científicas , experimentadores que estudian las macromoléculas mediante otras técnicas, y teóricos y bioinformáticos que estudian propiedades más generales de las moléculas biológicas. Sus intereses y necesidades varían, pero todos se benefician enormemente de una comprensión global y local de la fiabilidad de los modelos.

Resumen histórico

La cristalografía macromolecular fue precedida por el campo más antiguo de la cristalografía de rayos X de moléculas pequeñas (para estructuras con menos de unos pocos cientos de átomos). Los datos de difracción de moléculas pequeñas alcanzan una resolución mucho mayor que la posible para macromoléculas y presentan una relación matemática muy precisa entre los datos y el modelo atómico. El residuo, o factor R, mide la concordancia entre los datos experimentales y los valores recalculados a partir del modelo atómico. Para una estructura de molécula pequeña bien determinada, el factor R es casi tan pequeño como la incertidumbre en los datos experimentales (muy inferior al 5%). Por lo tanto, esa prueba por sí sola proporciona la mayor parte de la validación necesaria, pero se realizan varias comprobaciones adicionales de consistencia y metodología mediante software automatizado [ 3 ] como requisito para los artículos sobre estructuras cristalinas de moléculas pequeñas que se envían a las revistas de la Unión Internacional de Cristalografía (IUCr), como Acta Crystallographica sección B o C. Las coordenadas atómicas de estas estructuras de moléculas pequeñas se archivan y se pueden consultar a través de la Base de Datos Estructural de Cambridge (CSD) [ 4 ] o la Base de Datos Abierta de Cristalografía (COD) [ 5 ] .

El primer software de validación macromolecular se desarrolló alrededor de 1990, para proteínas. Incluía validación cruzada Rfree para la coincidencia modelo-datos, [ 6 ] parámetros de longitud y ángulo de enlace para geometría covalente, [ 7 ] y criterios conformacionales de cadena lateral y esqueleto. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] Para estructuras macromoleculares, los modelos atómicos se depositan en el Protein Data Bank (PDB), que sigue siendo el único archivo de estos datos. El PDB se estableció en la década de 1970 en el Brookhaven National Laboratory , [ 11 ] se trasladó en 2000 al RCSB Archived 2008-08-28 en la Wayback Machine (Research Collaboration for Structural Biology) centrado en Rutgers , [ 12 ] y se expandió en 2003 para convertirse en el wwPDB ( worldwide Protein Data Bank ), [ 13 ] con sitios de acceso añadidos en Europa () y Asia (), y con datos de RMN gestionados en el BioMagResBank (BMRB) en Wisconsin.

La validación se convirtió rápidamente en un estándar en el campo, [ 14 ] con desarrollos posteriores que se describen a continuación. *Obviamente necesita ampliarse*

Se dio un gran impulso a la aplicabilidad de la validación integral tanto para rayos X como para RMN a partir del 1 de febrero de 2008, cuando el Banco Mundial de Datos de Proteínas (wwPDB) hizo obligatorio el depósito de datos experimentales junto con las coordenadas atómicas. Desde 2012, se han estado adoptando formas sólidas de validación para el depósito en wwPDB a partir de las recomendaciones de los comités del Grupo de Trabajo de Validación de wwPDB para cristalografía de rayos X , [ 15 ] para RMN, [ 16 ] para SAXS ( dispersión de rayos X de ángulo pequeño ) y para crio-EM ( microscopía crioelectrónica ). [ 17 ]

Etapas de validación

Las validaciones se pueden dividir en tres etapas: validación de los datos brutos recopilados (validación de datos), interpretación de los datos en el modelo atómico (validación del modelo a los datos) y, finalmente, validación del modelo en sí. Si bien los dos primeros pasos son específicos de la técnica utilizada, la validación de la disposición de los átomos en el modelo final no lo es.

Validación del modelo

Geometría

[ 7 ] [ 18 ] [ 19 ]

Conformación (ángulos diedros): proteínas y ARN

Se ha demostrado que los ángulos diedros del esqueleto y de las cadenas laterales de las proteínas y el ARN presentan combinaciones específicas de ángulos permitidos (o prohibidos). Para los ángulos diedros del esqueleto proteico (φ, ψ), esto se ha abordado mediante el legendario diagrama de Ramachandran, mientras que para los ángulos diedros de las cadenas laterales (χ), se debe consultar la biblioteca de rotámeros dependiente del esqueleto de Dunbrack . [ 20 ]

Aunque las estructuras de ARNm son generalmente de corta duración y monocatenarias, existe una abundancia de ARN no codificantes con diferentes plegamientos secundarios y terciarios (ARNt, ARNr, etc.) que contienen una preponderancia de pares de bases canónicos de Watson-Crick (WC), junto con un número significativo de pares de bases no Watson-Crick (NWC), para los cuales dichos ARN también califican para la validación estructural regular que se aplica a las hélices de ácidos nucleicos. La práctica estándar es analizar los parámetros geométricos intra- (Transnacional: Desplazamiento, Deslizamiento, Elevación; Rotacional: Inclinación, Giro, Torsión) e inter-pares de bases (Transnacional: Cizallamiento, Desplazamiento, Estiramiento, Rotacional: Doblado, Hélice, Apertura), ya sea dentro o fuera del rango con respecto a sus valores sugeridos. [ 21 ] [ 22 ] Estos parámetros describen las orientaciones relativas de las dos bases apareadas entre sí en dos hebras (intra) junto con las de los dos pares de bases apiladas (inter) entre sí, y, por lo tanto, juntos, sirven para validar las estructuras de los ácidos nucleicos en general. Dado que las hélices de ARN son de longitud corta (promedio: 10-20 pb), se ha encontrado que el uso del potencial electrostático de superficie como parámetro de validación [ 23 ] es beneficioso, particularmente para fines de modelado.

Empaquetamiento y electrostática: proteínas globulares

Para las proteínas globulares, se ha demostrado que el empaquetamiento atómico interno (que surge de interacciones locales de corto alcance) de las cadenas laterales [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] es fundamental en la estabilización estructural del plegamiento de la proteína. Por otro lado, también se ha demostrado que la armonía electrostática (no local, de largo alcance) del plegamiento general [ 28 ] es esencial para su estabilización. Las anomalías de empaquetamiento incluyen choques estéricos, [ 29 ] contactos cortos, [ 27 ] agujeros [ 30 ] y cavidades [ 31 ] mientras que la desarmonía electrostática [ 28 ] [ 32 ] se refiere a cargas parciales desequilibradas en el núcleo de la proteína (particularmente relevante para interiores de proteínas diseñados). Mientras que la puntuación de choque de Molprobity identifica choques estéricos con una resolución muy alta, el gráfico de complementariedad combina anomalías de empaquetamiento con desequilibrio electrostático de cadenas laterales y señales para uno o ambos.

Carbohidratos

Diagrama 2D de un N-glicano unido a un fragmento de anticuerpo en la estructura con código de acceso PDB ' 4BYH ' . Este diagrama, generado con Privateer, [ 33 ] sigue la nomenclatura de símbolos estándar [ 34 ] e incluye, en su formato svg original, anotaciones con información de validación, como la conformación del anillo y los tipos de monosacáridos detectados.

La naturaleza ramificada y cíclica de los carbohidratos plantea problemas particulares para las herramientas de validación de estructuras. [ 35 ] A resoluciones más altas, es posible determinar la secuencia/estructura de oligo- y polisacáridos, tanto como modificaciones covalentes como ligandos. Sin embargo, a resoluciones más bajas (típicamente inferiores a 2,0 Å), las secuencias/estructuras deben coincidir con estructuras conocidas o estar respaldadas por técnicas complementarias como la espectrometría de masas. [ 36 ] Además, los monosacáridos tienen preferencias conformacionales claras (los anillos saturados se encuentran típicamente en conformaciones de silla), [ 37 ] pero los errores introducidos durante la construcción y/o refinamiento del modelo (quiralidad o distancia de enlace incorrecta, o elección incorrecta del modelo - ver [ 38 ] para recomendaciones sobre la construcción y refinamiento de modelos de carbohidratos y [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] para revisiones sobre errores generales en estructuras de carbohidratos) pueden hacer que sus modelos atómicos salgan del estado de baja energía más probable. Alrededor del 20% de las estructuras de carbohidratos depositadas se encuentran en una conformación de mayor energía que no está justificada por los datos estructurales (medida mediante el coeficiente de correlación en el espacio real). [ 42 ]

En glycosciences.de se encuentran disponibles varios servicios web de validación de carbohidratos (que incluyen comprobaciones de nomenclatura y de enlaces mediante pdb-care , [ 43 ] y validación cruzada con datos de espectrometría de masas mediante GlycanBuilder), mientras que la suite CCP4 distribuye actualmente Privateer , [ 33 ] una herramienta integrada en el propio proceso de construcción y refinamiento del modelo. Privateer puede comprobar la estereoquímica y la regioquímica, la conformación y el plegamiento del anillo, las torsiones de los enlaces y la correlación en el espacio real frente a la densidad de omisión positiva, generando restricciones de torsión aperiódicas en los enlaces del anillo, que pueden ser utilizadas por cualquier software de refinamiento para mantener la conformación de energía mínima del monosacárido. [ 33 ]

Privateer también genera diagramas SVG bidimensionales escalables según la nomenclatura de símbolos estándar de Essentials of Glycobiology [ 34 ], que contienen toda la información de validación como anotaciones emergentes (véase la figura). Esta funcionalidad está integrada actualmente en otros programas de CCP4, como el programa de gráficos moleculares CCP4mg (a través de la representación Glycoblocks 3D [ 44 ] , que se ajusta a la nomenclatura de símbolos estándar [ 34 ] ) y la interfaz gráfica del paquete, CCP4i2.

Validación para cristalografía

Consideraciones generales

Criterios globales frente a criterios locales

Muchos criterios de evaluación se aplican globalmente a toda una estructura experimental, en particular la resolución , la anisotropía o incompletitud de los datos y el residuo o factor R que mide la concordancia general entre el modelo y los datos (véase más abajo). Estos criterios ayudan al usuario a elegir la entrada más precisa del Protein Data Bank para responder a sus preguntas. Otros criterios se aplican a residuos individuales o regiones locales de la estructura 3D, como el ajuste al mapa de densidad electrónica local o las colisiones estéricas entre átomos. Estos criterios son especialmente valiosos para el biólogo estructural a la hora de mejorar el modelo, y para el usuario a la hora de evaluar la fiabilidad de dicho modelo en la zona de interés, como un sitio de actividad enzimática o de unión de fármacos. Ambos tipos de medidas son muy útiles, pero aunque los criterios globales son más fáciles de enunciar o publicar, los criterios locales son los que más contribuyen a la precisión científica y la relevancia biológica. Como se expresa en el libro de texto de Rupp: «Solo la validación local, que incluye la evaluación tanto de la geometría como de la densidad electrónica, puede ofrecer una imagen precisa de la fiabilidad del modelo estructural o de cualquier hipótesis basada en las características locales del modelo». [ 45 ]

¿Qué se puede observar en las estructuras cristalinas macromoleculares de baja y alta resolución?

Relación con la resolución y el factor B

Validación de datos

Factores estructurales

Hermanamiento

Validación del modelo con los datos

Residuos y Rfree

Correlación en el espacio real

Mejora mediante la corrección de los problemas diagnosticados.

En resonancia magnética nuclear

Validación de datos: Desplazamientos químicos, NOE, RDC

AVS
El conjunto de validación de asignaciones ( AVS ) comprueba la lista de desplazamientos químicos en formato BioMagResBank (BMRB) en busca de problemas. [ 46 ]
PSVS
Servidor de validación de la estructura de proteínas en el NESG basado en estadísticas de recuperación de información [ 47 ]
PROCESO
PROSESS (Protein Structure Evaluation Suite & Server) es un nuevo servidor web que ofrece una evaluación de modelos estructurales de proteínas mediante desplazamientos químicos de RMN, así como efectos NOE, parámetros geométricos y basados ​​en el conocimiento.
LACS
El análisis lineal de los desplazamientos químicos se utiliza para la referenciación absoluta de los datos de desplazamiento químico.

Validación del modelo con los datos

TALOS+ . Predice los ángulos de torsión del esqueleto proteico a partir de datos de desplazamiento químico. Se utiliza frecuentemente para generar restricciones adicionales que se aplican a un modelo estructural durante el refinamiento.

Validación del modelo: como se indica arriba

Conjunto estructural de RMN para el archivo PDB 2K5D, con una estructura bien definida para las hebras beta (flechas) y regiones indefinidas, presumiblemente muy móviles, para el bucle naranja y el extremo N azul.

Dinámica: núcleo frente a bucles, colas y dominios móviles

Una de las necesidades críticas para la validación de conjuntos estructurales mediante RMN es distinguir las regiones bien definidas (aquellas que cuentan con datos experimentales) de las regiones altamente móviles o sin datos observados. Existen varios métodos actuales o propuestos para realizar esta distinción, como el Índice de Bobina Aleatoria , pero hasta el momento la comunidad de RMN no ha estandarizado ninguno.

Software y sitios web

En criomicroscopía electrónica

La crio-microscopía electrónica presenta desafíos especiales para los constructores de modelos, ya que la densidad electrónica observada suele ser insuficiente para distinguir átomos individuales, lo que conlleva una mayor probabilidad de errores.

Las herramientas de validación basadas en la geometría, similares a las utilizadas en la cristalografía de rayos X, pueden emplearse para resaltar opciones de modelado poco plausibles y guiar al modelador hacia estructuras más parecidas a las nativas. El método CaBLAM, que solo utiliza átomos de Cα, [ 48 ] es adecuado para estructuras de baja resolución obtenidas mediante crio-EM. [ 49 ]

Se ha formulado una forma de calcular el mapa de densidad diferencial para crio-EM. [ 50 ] [ 51 ] También está disponible la validación cruzada utilizando un mapa "libre", comparable al uso de un factor R libre . [ 52 ] [ 53 ] Otros métodos para comprobar el ajuste del modelo-mapa incluyen coeficientes de correlación, FSC del modelo-mapa, [ 54 ] mapas de confianza, CryoEF (comprobación del sesgo de orientación) y TEMPy SMOC. [ 51 ]

En SAXS

La SAXS (dispersión de rayos X de ángulo pequeño) es un área de determinación de estructuras en rápido crecimiento, tanto como fuente de estructura 3D aproximada para casos iniciales o difíciles como componente de métodos híbridos de determinación de estructuras cuando se combina con información de RMN, EM, cristalografía, reticulación o computacional. Existe un gran interés en el desarrollo de estándares de validación fiables para la interpretación de datos SAXS y para la calidad de los modelos resultantes, pero aún no existen métodos establecidos de uso generalizado. Tres pasos recientes en esta dirección son la creación de un comité del Grupo de Trabajo de Validación de Dispersión de Ángulo Pequeño por parte del Protein Data Bank mundial y su informe inicial, [ 55 ] un conjunto de estándares sugeridos para la inclusión de datos en publicaciones, [ 56 ] y una propuesta inicial de criterios derivados estadísticamente para la evaluación automatizada de la calidad. [ 57 ]

Para la biología computacional

Es difícil realizar una validación significativa de un modelo macromolecular individual, puramente computacional, en ausencia de datos experimentales para esa molécula, porque el modelo con la mejor geometría y puntuación conformacional puede no ser el más cercano a la respuesta correcta. Por lo tanto, gran parte del énfasis en la validación del modelado computacional se centra en la evaluación de los métodos. Para evitar sesgos y ilusiones, se han organizado competiciones de predicción doble ciego, cuyo ejemplo original (celebrado cada 2 años desde 1994) es CASP (Evaluación Crítica de la Predicción de Estructura) para evaluar predicciones de la estructura 3D de proteínas para estructuras cristalográficas o de RMN recientemente resueltas que se mantienen confidenciales hasta el final de la competición correspondiente. [ 58 ] El criterio principal para la evaluación de CASP es una puntuación ponderada llamada GDT-TS para la coincidencia de las posiciones Cα entre los modelos predichos y experimentales. [ 59 ]

Véase también

Referencias

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  • Predicción computacional
    • Página principal de los experimentos CASP
    • Validación de modelos en Yasara
  • Validación de estructura de propósito general
    • Sitio de validación/depósito ( versión wwPDB )
    • Servicio web MolProbity (con funciones específicas para RMN)
    • PDBREPORT (Base de datos de validación de la estructura de proteínas
    • Software What_Check archivado el 1 de mayo de 2011 en Wayback Machine.
    • Software ProCheck
    • Trama de complementariedad
    • pdb-care (validación de carbohidratos)
    • Corsario (validación de carbohidratos)
    • OOPS2, parte de la Fábrica de Software de Uppsala
    • Servicio web ProSA
    • Verificar el análisis del perfil 3D
    • NUPARM (Validación de Ácidos Nucleicos)
    • RNAhelix (validación de ARN)
  • radiografía
    • EDS (Electron Density Server) Archivado el 2 de julio de 2017 en Wayback Machine [ 1 ]
    • Coot - software de modelado (validación integrada)[ 2 ]
    • PDB-REDO - Optimización del modelo de rayos X: reconstrucción y refinamiento de todos los modelos PDB utilizando técnicas actualizadas [ 3 ]
    • PROSESS - Suite y servidor para la evaluación de la estructura de proteínas
    • Resolución por Proxy , ResProx - resolución de modelos de proteínas por proxy
    • VADAR - Informador de volumen, área y ángulo diedro
  • RMN
    • Software CING (Interfaz común para la generación de estructuras por RMN)
    • ProCheck : control de calidad estereoquímica para rayos X y RMN [ 4 ]
    • Software y servidor TALOS+ (servidor para predecir los ángulos de torsión de la cadena principal de las proteínas a partir del desplazamiento químico)
    • VADAR - Informador de volumen, área y ángulo diedro
    • PROSESS - Suite y servidor para la evaluación de la estructura de proteínas
    • ResProx - resolución de modelos de proteínas por medio de un proxy
  • Criomicroscopía electrónica
    • Banco de datos EM, para el depósito de mapas EM
    • EMDB en el PDB, información sobre la descarga de mapas por FTP
    • CERES reconstruye (y con suerte mejora) los modelos de crio-EM utilizando la última versión de PHENIX [ 5 ].

Lecturas adicionales

  • Cavanagh J, Fairbrother WJ, Palmer AG, Skelton NJ (2006). Espectroscopia de RMN de proteínas: Principios y práctica (2.ª  ed.). Academic Press. ISBN 978-0-12-164491-8.
  • Rupp B (2009). Cristalografía biomolecular: principios, práctica y aplicación a la biología estructural . Garland Science. ISBN 978-0815340812.
  1. ↑ Kleywegt GJ, Harris MR, Zou JY, Taylor TC, Wählby A, Jones TA (diciembre de 2004). "El servidor de densidad electrónica de Uppsala" . Acta Crystallographica Sección D. 60 ( Pt 12 Pt 1): 2240–9 . Bibcode : 2004AcCrD..60.2240K . doi : 10.1107/s0907444904013253 . PMID 15572777 . 
  2. ↑ Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K (abril de 2010). "Características y desarrollo de Coot" . Acta Crystallographica Sección D. 66 ( Pt 4): 486–501 . Bibcode : 2010AcCrD..66..486E . doi : 10.1107/s0907444910007493 . PMC 2852313. PMID 20383002 .  
  3. ↑ Joosten RP, Joosten K, Murshudov GN, Perrakis A (abril de 2012). "PDB_REDO: validación constructiva, más que solo buscar errores" . Acta Crystallographica Sección D. 68 ( Pt 4): 484–96 . Bibcode : 2012AcCrD..68..484J . doi : 10.1107/ s0907444911054515 . PMC 3322608. PMID 22505269 .  
  4. ↑ Laskowski RA, Rullmannn JA, MacArthur MW, Kaptein R, Thornton JM (diciembre de 1996). "AQUA y PROCHECK-NMR: programas para comprobar la calidad de las estructuras proteicas resueltas por RMN". Journal of Biomolecular NMR . 8 (4): 477– 86. doi : 10.1007/bf00228148 . PMID 9008363 . S2CID 45664105 .  
  5. ↑ Liebschner, D; Afonine, PV; Moriarty, NW; Poon, BK; Chen, VB; Adams, PD (1 de enero de 2021). "CERES: un sistema de refinamiento por crio-EM para la mejora continua de modelos depositados" . Acta Crystallographica Sección D. 77 ( Pt 1): 48–61 . Bibcode : 2021AcCrD..77...48L . doi : 10.1107/S2059798320015879 . PMC 7787109. PMID 33404525 .  
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