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Articulo de referencia

Marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares

Principio de SILAC . Las células se marcan diferencialmente cultivándolas en un medio ligero con arginina normal (Arg-0, color azul) o en un medio con arginina pesada (Arg-6, co...

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Principio de SILAC . Las células se marcan diferencialmente cultivándolas en un medio ligero con arginina normal (Arg-0, color azul) o en un medio con arginina pesada (Arg-6, color rojo). La incorporación metabólica de los aminoácidos a las proteínas produce un cambio de masa en los péptidos correspondientes. Este cambio de masa se puede detectar mediante un espectrómetro de masas , como se muestra en los espectros de masas representados. Al combinar ambas muestras, la relación de intensidades de los picos en el espectro de masas refleja la abundancia relativa de la proteína. En este ejemplo, la proteína marcada tiene la misma abundancia en ambas muestras (relación 1).

El marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares ( SILAC ) es una técnica basada en espectrometría de masas que detecta diferencias en la abundancia de proteínas entre muestras utilizando marcaje isotópico no radiactivo . [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] Es un método popular para la proteómica cuantitativa .

Procedimiento

Se cultivan dos poblaciones de células en un cultivo celular . Una de las poblaciones se alimenta con un medio de crecimiento que contiene aminoácidos normales . En cambio, la segunda población se alimenta con un medio de crecimiento que contiene aminoácidos marcados con isótopos pesados ​​estables (no radiactivos) . Por ejemplo, el medio puede contener arginina marcada con seis átomos de carbono-13 ( ¹³C ) en lugar del carbono-12 normal ( ¹²C ). Cuando las células crecen en este medio, incorporan la arginina pesada a todas sus proteínas. Posteriormente, todos los péptidos que contienen una sola arginina son 6 Da más pesados ​​que sus homólogos normales. Alternativamente, se puede utilizar un marcaje uniforme con ¹³C o ¹⁵N. Las proteínas de ambas poblaciones celulares se combinan y se analizan conjuntamente mediante espectrometría de masas , ya que los pares de péptidos químicamente idénticos con diferente composición de isótopos estables se pueden diferenciar en un espectrómetro de masas debido a su diferencia de masa. La relación de intensidades de los picos en el espectro de masas para dichos pares de péptidos refleja la relación de abundancia de las dos proteínas. [ 5 ] [ 3 ]

Aplicaciones

Se ha utilizado un enfoque SILAC que implica la incorporación de tirosina marcada con nueve átomos de carbono-13 ( 13C ) en lugar del carbono-12 normal ( 12C ) para estudiar sustratos de tirosina quinasa en vías de señalización. [ 6 ] SILAC ha surgido como un método muy potente para estudiar la señalización celular , modificaciones postraduccionales como la fosforilación , [ 6 ] [ 7 ] interacción proteína-proteína y regulación de la expresión génica . Además, SILAC se ha convertido en un método importante en secretómica , el estudio global de proteínas secretadas y vías secretoras. [ 8 ] Puede utilizarse para distinguir entre proteínas secretadas por células en cultivo y contaminantes del suero. [ 9 ] También se ha adaptado como un método SILAC 'directo+inverso' para el marcaje simultáneo del huésped y el microbio, lo que permite el estudio de las interacciones huésped-microbio. [ 10 ] También se han publicado protocolos estandarizados de SILAC para diversas aplicaciones. [ 11 ] [ 12 ]

SILAC pulsado

El SILAC pulsado (pSILAC) es una variación del método SILAC en la que los aminoácidos marcados se añaden al medio de cultivo durante un breve periodo de tiempo. Esto permite monitorizar las diferencias en la producción de proteínas de novo en lugar de la concentración bruta. [ 13 ] [ 14 ]

NeuCode SILAC

Tradicionalmente, el nivel de multiplexación en SILAC era limitado debido a la cantidad de isótopos SILAC disponibles. Recientemente, una nueva técnica llamada NeuCode (codificación de neutrones) SILAC ha aumentado el nivel de multiplexación alcanzable con el marcaje metabólico (hasta 4). [ 15 ] El método de aminoácidos NeuCode es similar a SILAC, pero difiere en que el marcaje solo utiliza aminoácidos pesados. El uso de solo aminoácidos pesados ​​elimina la necesidad de la incorporación del 100% de los aminoácidos necesarios para SILAC. La mayor capacidad de multiplexación de los aminoácidos NeuCode se debe al uso de defectos de masa de neutrones adicionales en los isótopos estables. Sin embargo, estas pequeñas diferencias de masa deben resolverse en espectrómetros de masas de alta resolución.

Referencias

  1. ^ Oda Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT (junio de 1999). "Cuantificación precisa de la expresión de proteínas y la fosforilación específica del sitio" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 96 (12): 6591– 6596. Bibcode : 1999PNAS...96.6591O . doi : 10.1073/pnas.96.12.6591 . PMC  21959. PMID  10359756 .
  2. ^ Jiang H, English AM (2002). "Análisis cuantitativo del proteoma de levadura mediante la incorporación de leucina marcada isotópicamente". Journal of Proteome Research . 1 (4): 345– 350. doi : 10.1021/pr025523f . PMID 12645890 . 
  3. ^ a b Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (mayo de 2002). "Marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares, SILAC, como un enfoque simple y preciso para la proteómica de expresión" . Molecular & Cellular Proteomics . 1 (5): 376– 386. doi : 10.1074/mcp.M200025-MCP200 . PMID 12118079 . 
  4. ^ Zhu H, Pan S, Gu S, Bradbury EM, Chen X (2002). "Marcaje isotópico estable específico de residuos de aminoácidos para proteómica cuantitativa" . Rapid Communications in Mass Spectrometry . 16 (22): 2115– 2123. Bibcode : 2002RCMS...16.2115Z . doi : 10.1002/rcm.831 . PMID 12415544 . 
  5. ^ Schoeters F, Van Dijck P (2019). "Interacciones proteína-proteína en Candida albicans " . Fronteras en Microbiología . 10 : 1792. doi : 10.3389/fmicb.2019.01792 . PMC 6693483 . PMID 31440220 .  
  6. ^ a b Ibarrola N, Molina H, Iwahori A, Pandey A (abril de 2004). "Un nuevo enfoque proteómico para la identificación específica de sustratos de tirosina quinasa utilizando [13C]tirosina" . The Journal of Biological Chemistry . 279 (16): 15805– 15813. doi : 10.1074/jbc.M311714200 . PMID 14739304 . 
  7. ^ Ibarrola N, Kalume DE, Gronborg M, Iwahori A, Pandey A (noviembre de 2003). "Un enfoque proteómico para la cuantificación de la fosforilación mediante marcaje con isótopos estables en cultivos celulares". Analytical Chemistry . 75 (22): 6043– 6049. doi : 10.1021/ac034931f . PMID 14615979 . 
  8. ^ Hathout Y (abril de 2007). " Enfoques para el estudio del secretoma celular". Expert Review of Proteomics . 4 (2): 239– 248. doi : 10.1586/14789450.4.2.239 . PMID 17425459. S2CID 26169223 .  
  9. ^ Polacek M, Bruun JA, Johansen O, Martinez I (agosto de 2010). "Diferencias en el secretoma de explantes de cartílago y condrocitos cultivados reveladas por la tecnología SILAC" . Journal of Orthopaedic Research . 28 (8): 1040– 1049. doi : 10.1002/jor.21067 . PMID 20108312. S2CID 41057768 .  
  10. ^ Liu, Yang Sylvia; Zhang, Chengqian; Khoo, Bee Luan; Hao, Piliang; Chua, Song Lin (2024-09-02). "Proteómica de doble especie e intervención dirigida de las interacciones animal-patógeno" . Journal of Advanced Research . doi : 10.1016/j.jare.2024.08.038 . ISSN 2090-1232 . PMC 12225907 .  
  11. ^ Amanchy R, Kalume DE, Pandey A (enero de 2005). "Marcaje con isótopos estables de aminoácidos en cultivos celulares (SILAC) para estudiar la dinámica de la abundancia de proteínas y las modificaciones postraduccionales". Science 's STKE . 2005 (267): pl2. doi : 10.1126/stke.2672005pl2 . PMID 15657263. S2CID 12089034 .  
  12. ^ Harsha HC, Molina H, Pandey A (2008). "Proteómica cuantitativa mediante marcaje con isótopos estables de aminoácidos en cultivos celulares". Nature Protocols . 3 (3): 505– 516. doi : 10.1038/nprot.2008.2 . PMID 18323819 . S2CID 24190501 .  
  13. ^ Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M (enero de 2009). "Análisis global de la traducción de proteínas celulares mediante SILAC pulsado". Proteomics . 9 (1): 205–209 . doi : 10.1002/pmic.200800275 . PMID 19053139. S2CID 23130202 .  
  14. ^ Chua, canción Lin; Ñame, Joey Kuok Hoong; Hao, Piliang; Adav, Sunil S.; Salido, May Margarette; Liu, Yang; Givskov, Michael; Sze, Siu Kwan; Tolker-Nielsen, Tim; Yang, Liang (19 de febrero de 2016). "Etiquetado selectivo y erradicación de poblaciones bacterianas tolerantes a antibióticos en biopelículas de Pseudomonas aeruginosa" . Comunicaciones de la naturaleza . 7 (1) 10750. doi : 10.1038/ncomms10750 . ISSN 2041-1723 . PMC 4762895 .  
  15. ^ Merrill AE, Hebert AS, MacGilvray ME, Rose CM, Bailey DJ, Bradley JC, et al. (septiembre de 2014). "Etiquetas NeuCode para la cuantificación relativa de proteínas" . Molecular & Cellular Proteomics . 13 (9): 2503– 2512. doi : 10.1074/mcp.M114.040287 . PMC 4159665. PMID 24938287 .  

Lecturas adicionales

  • Ong SE, Kratchmarova I, Mann M (2003). "Propiedades de la arginina sustituida con 13C en el marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares (SILAC)". Journal of Proteome Research . 2 (2): 173– 181. doi : 10.1021/pr0255708 . PMID  12716131 .
  • Ong SE, Mann M (2006). "Una receta práctica para el marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares (SILAC)". Nature Protocols . 1 (6): 2650– 2660. doi : 10.1038/nprot.2006.427 . PMID  17406521 . S2CID  10651610 .
  • Ong SE, Mann M (2007). «Marcaje con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares para proteómica cuantitativa». Proteómica cuantitativa por espectrometría de masas . Métodos en biología molecular. Vol. 359. pp.  37–52 . doi : 10.1007/978-1-59745-255-7_3 . ISBN 978-1-58829-571-2. PMID  17484109 .
  • Recurso SILAC del Laboratorio Mann
  • Recurso SILAC del Laboratorio Pandey
  • Centro de recursos SILAC para bioinformática experimental (CEBI)
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