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Recombinación

La recombinación ( ingeniería genética mediada por recombinación ) [1] es una técnica de biología molecular y genética basada en sistemas de recombinación homóloga , a diferenci...

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La recombinación ( ingeniería genética mediada por recombinación ) [1] es una técnica de biología molecular y genética basada en sistemas de recombinación homóloga , a diferencia del método más antiguo/más común de usar enzimas de restricción y ligasas para combinar secuencias de ADN en un orden específico. La recombinación se usa ampliamente para la genética bacteriana, en la generación de vectores objetivo para hacer un knockout condicional de ratón y para modificar ADN de cualquier fuente a menudo contenido en un cromosoma artificial bacteriano (BAC), entre otras aplicaciones.

Desarrollo

Aunque se desarrollaron en bacterias, gran parte de la inspiración para las técnicas de recombinación provino de métodos desarrollados por primera vez en Saccharomyces cerevisiae [2] donde se utilizó un plásmido lineal para apuntar a genes o clonar genes fuera del cromosoma. Además, la recombinación con oligonucleótidos de cadena sencilla (oligos) se demostró por primera vez en Saccharomyces cerevisiae [3] . Se observó que la recombinación se producía con oligonucleótidos de tan solo 20 bases.

La recombinación se basa en la recombinación homóloga en Escherichia coli mediada por proteínas de bacteriófagos , ya sea RecE/RecT del profago Rac [4] o Redαβδ del bacteriófago lambda . [5] [6] El sistema de recombinación Red lambda es el más utilizado en la actualidad y las primeras demostraciones de ingeniería genética in vivo de Red fueron realizadas de forma independiente por Kenan Murphy [7] y Francis Stewart. [4] [5] Sin embargo, los experimentos de Murphy requerían la expresión de RecA y también empleaban brazos de homología largos. En consecuencia, las implicaciones para una nueva tecnología de ingeniería de ADN no eran obvias. El laboratorio de Stewart demostró que estos sistemas de recombinación homóloga median la recombinación eficiente de moléculas de ADN lineales flanqueadas por secuencias de homología tan cortas como 30 pares de bases (40-50 pares de bases son más eficientes) en secuencias de ADN objetivo en ausencia de RecA. Ahora la homología podría ser proporcionada por oligonucleótidos hechos a pedido, y podrían usarse huéspedes de clonación recA estándar, expandiendo enormemente la utilidad de la recombinación.

Recombinación con dsDNA

La recombinación utiliza sustratos de ADN lineal que son de doble cadena (dsDNA) o de cadena sencilla (ssDNA). Más comúnmente, la recombinación de dsDNA se ha utilizado para crear reemplazos, deleciones, inserciones e inversiones de genes. La clonación de genes [6] [8] y el etiquetado de genes/proteínas (etiquetas His, etc., ver [9] ) también es común. Para reemplazos o deleciones de genes, generalmente se crea un casete que codifica un gen de resistencia a fármacos mediante PCR utilizando cebadores bipartitos. Estos cebadores constan de (de 5' → 3') 50 bases de homología con la región objetivo, donde se insertará el casete, seguido de 20 bases para cebar el casete resistente al fármaco. La secuencia de unión exacta del constructo final está determinada por el diseño del cebador. [10] [11] Estos eventos ocurren típicamente con una frecuencia de aproximadamente 10 4 /10 8 células que sobreviven a la electroporación . La electroporación es el método utilizado para transformar el sustrato lineal en la célula recombinante.

Técnica de selección/contraselección

En algunos casos, se desea una deleción sin dejar ningún marcador, para hacer una fusión de genes o para crear un mutante puntual en un gen. Esto se puede hacer con dos rondas de recombinación. [12] En la primera etapa de la recombinación, se introduce un marcador de selección en un casete para reemplazar la región que se va a modificar. En la segunda etapa, se selecciona un segundo marcador de contraselección (por ejemplo, sacB) en el casete después de la introducción de un fragmento objetivo que contiene la modificación deseada. Alternativamente, el fragmento objetivo podría estar flanqueado por sitios loxP o FRT , que podrían eliminarse más tarde simplemente mediante la expresión de las recombinasas Cre o FLP, respectivamente. También se desarrolló un nuevo marcador de selección "mFabI" para aumentar la eficiencia de la recombinación. [13]

Recombinación con ssDNA

La recombinación con ssDNA supuso un gran avance tanto en la eficiencia de la reacción como en la facilidad para realizar mutaciones puntuales. [1] Esta técnica se mejoró aún más con el descubrimiento de que al evitar el sistema de reparación de desajustes dirigido por metilo, la frecuencia de obtención de recombinantes puede aumentarse a más de 10 7 /10 8 células viables. [14] Esta frecuencia es lo suficientemente alta como para que ahora se puedan realizar alteraciones sin selección. Con protocolos optimizados, más del 50% de las células que sobreviven a la electroporación contienen el cambio deseado. La recombinación con ssDNA solo requiere la proteína Red Beta; Exo, Gamma y las proteínas de recombinación del huésped no son necesarias. Como las proteínas homólogas a Beta y RecT se encuentran en muchas bacterias y bacteriófagos (>100 a febrero de 2010), es probable que la recombinación funcione en muchas bacterias diferentes. [15] Por lo tanto, la recombinación con ssDNA está ampliando las herramientas genéticas disponibles para la investigación en una variedad de organismos. Hasta la fecha, se ha realizado recombinación en E. coli , S. enterica , Y. pseudotuberculosis , S. cerevisiae y M. tuberculosis . [16] [17] [18] [19] [20] [21]

Recombinación independiente del rojo

En el año 2010, se ha demostrado que la recombinación de ssDNA puede ocurrir en ausencia de funciones de recombinación conocidas. [22] Se encontraron recombinantes en hasta 10 4 /10 8 células viables. Esta actividad independiente de Red se ha demostrado en P. syringae , E. coli , S. enterica serovar typhimurium y S. flexneria .

Aplicaciones y beneficios de la recombinación

La mayor ventaja de la recombinación es que obvia la necesidad de sitios de restricción convenientemente ubicados , mientras que en la ingeniería genética convencional, la modificación del ADN a menudo se ve comprometida por la disponibilidad de sitios de restricción únicos. En la ingeniería de grandes construcciones de >100 kb, como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), o cromosomas, la recombinación se ha convertido en una necesidad. La recombinación puede generar las modificaciones deseadas sin dejar ninguna "huella" detrás. También renuncia a múltiples etapas de clonación para generar vectores intermedios y, por lo tanto, se utiliza para modificar construcciones de ADN en un marco de tiempo relativamente corto. La homología requerida es lo suficientemente corta como para que pueda generarse en oligonucleótidos sintéticos y la recombinación con oligonucleótidos cortos en sí mismos es increíblemente eficiente. Recientemente, la recombinación se ha desarrollado para aplicaciones de ingeniería de ADN de alto rendimiento denominadas "tuberías de recombinación". [23] Los procesos de recombinación permiten la producción a gran escala de transgenes BAC y construcciones de selección de genes para programas de genómica funcional como EUCOMM (Consorcio Europeo de Mutagénesis Condicional en Ratones) y KOMP (Programa de Ratones Knock-Out). La recombinación también se ha automatizado, un proceso llamado "MAGE" (Ingeniería Genómica Automatizada Multiplexada), en el laboratorio de Church. [24] Con el desarrollo de las tecnologías CRISPR, la construcción de cepas de interferencia CRISPR en E. coli requiere solo una recombinación de oligonucleótidos en un solo paso, lo que proporciona una herramienta simple y fácil de implementar para el control de la expresión génica. [12] [25] También se han implementado "herramientas de recombinación" y protocolos de laboratorio para varias especies de plantas. Estas herramientas y procedimientos son personalizables, escalables y están disponibles gratuitamente para todos los investigadores. [26]

Referencias

  1. ^ ab Ellis HM, Yu D., DiTizio T., Court DL (2001). "Mutagénesis, reparación e ingeniería de alta eficiencia del ADN cromosómico utilizando oligonucleótidos monocatenarios". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 98 (12): 6742–6746. Bibcode :2001PNAS...98.6742E. doi : 10.1073/pnas.121164898 . PMC  34423 . PMID  11381128.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  2. ^ Orr-Weaver, TL, JW Szostak, et al. (1983) Aplicaciones genéticas de la transformación de levaduras con plásmidos lineales y con huecos. Métodos. Enzymol. 101: 228-245.
  3. ^ Moerschell RP, Tsunasawa S.; et al. (1988). "Transformación de levadura con oligonucleótidos sintéticos". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 85 (2): 524–528. Bibcode :1988PNAS...85..524M. doi : 10.1073/pnas.85.2.524 . PMC 279583 . PMID  2829192. 
  4. ^ ab Zhang Y., Buchholz F., Muyrers JP, Stewart AF (1998). "Una nueva lógica para la ingeniería de ADN utilizando la recombinación en Escherichia coli". Nature Genetics . 20 (2): 123–128. doi :10.1038/2417. PMID  9771703. S2CID  21186444.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  5. ^ ab Muyrers JP, Zhang Y., Testa G., Stewart AF (1999). "Modificación rápida de cromosomas artificiales bacterianos mediante recombinación ET". Investigación de ácidos nucleicos . 27 (6): 1555–1557. doi :10.1093/nar/27.6.1555. PMC 148353 . PMID  10037821. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  6. ^ ab Yu D., Ellis HM; et al. (2000). "Un sistema de recombinación eficiente para la ingeniería cromosómica en Escherichia coli". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 97 (11): 5978–5983. Bibcode :2000PNAS...97.5978Y. doi : 10.1073/pnas.100127597 . PMC 18544 . PMID  10811905. 
  7. ^ Murphy KC (1998). "Uso de funciones de recombinación del bacteriófago λ para promover el reemplazo de genes en Escherichia coli". Revista de bacteriología . 180 (8): 2063–2071. doi :10.1128/JB.180.8.2063-2071.1998. PMC 107131 . PMID  9555887. 
  8. ^ Zhang, Y., Muyrers, JPP, Testa, G. y Stewart, AF (2000) Clonación de ADN por recombinación homóloga en Escherichia coli Nature Biotechnology 18, 1314 - 1317
  9. ^ Poser I, Sarov M, Hutchins JR, Hériché JK, Toyoda Y, Pozniakovsky A, Weigl D, Nitzsche A, Hegemann B, Bird AW, Pelletier L, Kittler R, Hua S, Naumann R, Augsburg M, Sykora MM, Hofemeister H, Zhang Y, Nasmyth K, White KP, Dietzel S, Mechtler K, Durbin R, Stewart AF, Peters JM, Buchholz F, Hyman AA (2008). "BAC TransgeneOmics: un método de alto rendimiento para la exploración de la función de las proteínas en mamíferos". Nature Methods . 5 (5): 409–15. doi :10.1038/nmeth.1199. PMC 2871289 . PMID  18391959. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  10. ^ Sawitzke JA, Thomason LC, Costantino N., Bubunenko M., Datta S., Court DL (2007). "Recombinación: ingeniería genética in vivo en E. coli, S. enterica y más allá". Genética bacteriana avanzada: uso de transposones y fagos para ingeniería genómica . Métodos en enzimología. Vol. 421. págs. 171–199. doi :10.1016/S0076-6879(06)21015-2. ISBN 9780123737496. Número de identificación personal  17352923.{{cite book}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  11. ^ Thomason, L., DL Court, M. Bubunenko, N. Costantino, H. Wilson, S. Datta y A. Oppenheim, (2007) Recombinación: ingeniería genética en bacterias mediante recombinación homóloga. En: Current Protocols in Molecular Biology. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc., pp. Capítulo 1 Unidad 16 p. 11-24.
  12. ^ ab Li, X; Thomason, LC; Sawitzke, JA; Costantino, N; Court, DL (2013). "Selección positiva y negativa utilizando el casete tetA-sacB: recombinación y transducción de P1 en Escherichia coli". Investigación de ácidos nucleicos . 41 (22): e204. doi :10.1093/nar/gkt1075. PMC 3905872 . PMID  24203710. 
  13. ^ Un nuevo marcador de selección para la clonación y recombinación eficientes de ADN en E. coli
  14. ^ Costantino N., Court DL (2003). "Niveles mejorados de recombinantes mediados por λ Red en mutantes de reparación de desajustes". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 100 (26): 15748–15753. Bibcode :2003PNAS..10015748C. doi : 10.1073/pnas.2434959100 . PMC 307639 . PMID  14673109. 
  15. ^ Datta S., Costantino N., Zhou X., Court DL (2008). "Identificación y análisis de funciones de recombinación de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas y sus fagos". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 105 (5): 1626–1631. Bibcode :2008PNAS..105.1626D. doi : 10.1073/pnas.0709089105 . PMC 2234195 . PMID  18230724. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  16. ^ Derbise, A., B. Lesic, D. Dacheux, JM Ghigo y E. Carniel, (2003) Un método rápido y simple para inactivar genes cromosómicos en Yersinia. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 38: 113-116.
  17. ^ van Kessel JC, Hatfull GF (2007). "Recombinación en Mycobacterium tuberculosis". Nature Methods . 4 (2): 147–152. doi :10.1038/nmeth996. PMID  17179933. S2CID  2990045.
  18. ^ van Kessel JC, Hatfull GF (2008). "Recombinación micobacteriana". Protocolos de micobacterias . Métodos en biología molecular. Vol. 435. págs. 203-215. doi :10.1007/978-1-4939-2450-9_10. ISBN 978-1-4939-2449-3. Número de identificación personal  25779316.
  19. ^ van Kessel JC, Hatfull GF (2008). "Mutagénesis puntual eficiente en micobacterias mediante recombinación de ADN monocatenario: caracterización de dianas farmacológicas antimicobacterianas". Microbiología molecular . 67 (5): 1094–1107. doi :10.1111/j.1365-2958.2008.06109.x. PMID  18221264. S2CID  12136889.
  20. ^ van Kessel JC, Marinelli LJ, Hatfull GF (2008). "Recombinación de micobacterias y sus fagos". Nature Reviews Microbiology . 6 (11): 851–857. doi :10.1038/nrmicro2014. PMC 3503148 . PMID  18923412. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  21. ^ DiCarlo James E., Conley Andrew J., Penttilä Merja, Jäntti Jussi, Wang Harris H., Church George M. (2013). "Ingeniería genómica mediada por oligonucleótidos de levadura (YOGE)". ACS Synthetic Biology . 2 (12): 741–749. doi :10.1021/sb400117c. PMC 4048964 . PMID  24160921. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  22. ^ Swingle B., Markel E., Costantino N., Bubunenko MG, Cartinhour S., Court DL (2010). "Recombinación de oligonucleótidos en bacterias Gram-negativas". Microbiología molecular . 75 (1): 138–148. doi :10.1111/j.1365-2958.2009.06976.x. PMC 3404488 . PMID  19943907. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  23. ^ Sarov M., Schneider S., Pozniakovski A., Roguev A., Ernst S., Zhang Y., Hyman AA, Stewart AF (2006). "Un proceso de recombinación para la genómica funcional aplicada a Caenorhabditis elegans". Nature Methods . 3 (10): 839–844. doi :10.1038/nmeth933. PMID  16990816. S2CID  10658504.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  24. ^ Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, Sun ZZ, Xu G., Forest CR, Church GM (2009). "Programación de células mediante ingeniería genómica multiplexada y evolución acelerada". Nature . 460 (7257): 894–898. Bibcode :2009Natur.460..894W. doi :10.1038/nature08187. PMC 4590770 . PMID  19633652. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  25. ^ Li, X; Jun, Y; Erickstad, M; Brown, S; Parks, A; Court, D; Jun, S (2016). "tCRISPRi: control reversible y ajustable de la expresión génica en un solo paso". Scientific Reports . 6 : 39096. Bibcode :2016NatSR...639076L. doi :10.1038/srep39076. PMC 5171832 . PMID  27996021. 
  26. ^ Brumos J, Zhao C, Gong Y, Soriano D, Patel AP, Perez-Amador MA, Stepanova AN, Alonso JM (2019). "Un conjunto de herramientas de recombinación mejorado para plantas". The Plant Cell . 32 (1): 100–122. doi :10.1105/tpc.19.00431. PMC 6961616 . PMID  31666295. {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  • redrecombineering.ncifcrf.gov: detalles sobre la recombinación, así como protocolos, preguntas frecuentes y se puede utilizar para solicitar cepas y plásmidos necesarios para la recombinación.
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