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RPE65

La proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (también conocida como RPE65 ) es una enzima isomerohidrolasa retinoide del ciclo visual de los vertebrado...

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La proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (también conocida como RPE65 ) es una enzima isomerohidrolasa retinoide del ciclo visual de los vertebrados . [5] [6] La RPE65 se expresa en el epitelio pigmentario de la retina (RPE, una capa de células epiteliales que nutren las células fotorreceptoras ) y es responsable de la conversión de ésteres de retinilo todo-trans a 11-cis - retinol durante la fototransducción . [7] El 11-cis-retinol se utiliza luego en la regeneración del pigmento visual en las células fotorreceptoras . [8] [9] La RPE65 pertenece a la familia de enzimas carotenoides oxigenasas . [8]

Función

RPE65 es una enzima crítica en el ciclo visual de los vertebrados que se encuentra en el epitelio pigmentado de la retina. También se encuentra en bastones y conos. [10] La fotoisomerización de 11-cis-retinal a todo-trans-retinal inicia la vía de fototransducción a través de la cual el cerebro detecta la luz. El todo-trans-retinol no es fotoactivo y por lo tanto debe reconvertirse a 11-cis-retinal antes de que pueda recombinarse con opsina para formar un pigmento visual activo. [8] [11] RPE65 revierte la fotoisomerización al convertir un éster de todo-trans-retinilo en 11-cis-retinol. Lo más común es que el sustrato del éster sea palmitato de retinilo . Las demás enzimas del ciclo visual completan las reacciones necesarias para oxidar y esterificar el todo-trans-retinol a un éster de retinilo (sustrato de RPE65) y para oxidar el 11-cis-retinol a 11-cis-retinal (el componente de pigmento visual fotoactivo requerido). [8] [9]

La reacción completada por RPE65 en el ciclo de los retinoides.

La RPE65 también se conoce como isomerasa de retinol o isomerasa de retinoide, debido a debates anteriores sobre el sustrato de la enzima y si estaba involucrada en la hidrólisis del éster . [9]

Estructura

RPE65 es un dímero de dos subunidades simétricas e independientes enzimáticamente. El sitio activo de cada subunidad tiene una estructura de hélice beta de siete palas con cuatro histidinas que contienen un cofactor de hierro (II) . [9] [12] Este motivo estructural es común en todos los miembros estudiados de la familia de enzimas carotenoides oxigenasas . RPE65 está fuertemente asociado con la membrana del retículo endoplasmático liso en las células del epitelio pigmentario de la retina. [8]

Estructura del sitio activo

El sitio activo de cada sitio activo de RPE65 contiene un cofactor Fe(II) unido por cuatro histidinas (His 180 , His 241 , His 313 y His 527 ), cada una aportada por una hoja separada en la estructura de la hélice beta. Tres de las cuatro histidinas están coordinadas con residuos de ácido glutámico cercanos (Glu 148 , Glu 417 y Glu 469 ), que se cree que ayudan a posicionar las histidinas para unirse al cofactor de hierro en una geometría octaédrica . [13] Phe 103 , Thr 147 y Glu 148 rodean el sitio activo donde ayudan a estabilizar el intermedio carbocatión y aumentan la estereoselectividad de RPE65 para 11-cis-retinol sobre 13-cis-retinol. [9]

El cofactor de hierro (II) RPE65, mostrando su coordinación con 4 residuos de histidina y 3 residuos de ácido glutámico.

Los reactivos y productos probablemente entran y salen del sitio activo a través de un túnel hidrofóbico que se cree que se abre hacia la membrana lipídica para la absorción directa del sustrato lipídico. Un segundo túnel, más pequeño, también llega al sitio activo y puede servir como vía para el agua, pero es demasiado estrecho para transportar los reactivos y productos retinoides. [9] [13]

Interacciones de membrana

RPE65 está fuertemente asociada con la membrana del sER. sER es anormalmente abundante en las células del epitelio pigmentario de la retina debido a su papel en el procesamiento de retinoides lipídicos . Los estudios estructurales indican que RPE65 está parcialmente incrustado en la membrana del sER a través de interacciones entre su cara hidrofóbica y el interior de la membrana lipídica . Esto está respaldado por la necesidad de detergente para solubilizar RPE65. Una porción importante de la cara hidrofóbica de RPE65, los residuos 109-126, forma una hélice alfa anfipática que probablemente contribuye a la afinidad de la proteína por la membrana. Además, Cys 112 está palmitoilada en RPE65 nativo, lo que respalda aún más la teoría de que la cara hidrofóbica de RPE65 está incrustada en la membrana. [13]

La cara hidrofóbica contiene la entrada al gran túnel que conduce al sitio activo de la enzima . La presencia de este canal en la cara hidrofóbica combinada con la capacidad demostrada de RPE65 para absorber la dirección del sustrato desde la bicapa lipídica es consistente con que RPE65 esté parcialmente incrustado en la membrana. [8]

Conservación

El RPE65 se ha aislado de una amplia gama de vertebrados, incluidos peces cebra, pollos, ratones, ranas y humanos. [8] [14] [15] Su estructura está altamente conservada entre especies, particularmente en la hélice beta y en las regiones probablemente unidas a la membrana. Las secuencias de aminoácidos del RPE65 humano y bovino difieren en menos del 1%. [13] Los residuos de histidina de la estructura de la hélice beta y el cofactor de hierro(II) unido están 100% conservados en los ortólogos del RPE65 estudiados y otros miembros de la familia de las carotenoides oxigenasas . [9]

RPE65 soluble (sRPE65)

Anteriormente, se propuso que RPE65 existe en dos formas interconvertidas: mRPE65 unido a la membrana y sRPE65 soluble. Esta teoría sugería que la conversión reversible de sRPE65 a mRPE65 por palmitoilación en Cys 231 , Cys 329 y Cys 330 desempeñaba un papel en la regulación del ciclo de los retinoides y en la concesión de afinidad por la membrana a mRPE65. [16] Sin embargo, los estudios cristalográficos de RPE65 han demostrado que estos residuos no están palmitoilados ni orientados hacia la superficie. Nuevos estudios tampoco han podido confirmar la presencia de abundante RPE65 soluble. Por lo tanto, esta teoría ha sido abandonada en gran medida. [8] [13]

Mecanismo

Mecanismo de escisión de O-alquilo propuesto para RPE65. Los residuos que se muestran son, en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior izquierda: Phe 103 , Thr 147 , His 313 , His 527 , His 180 , His 241 y Glu 148 .

El RPE65 cataliza la conversión del éster de retinilo todo-trans en 11-cis-retinol a través de una escisión propuesta del enlace O-alquilo S N 1 . Actualmente se piensa que la combinación de escisión del éster de O-alquilo, isomerización geométrica y adición de agua del RPE65 es única en biología. Sin embargo, los químicos orgánicos utilizan reacciones de escisión del éster de O-alquilo con intermediarios carbocatiónicos estabilizados de manera similar. [9] [17]

Escisión de O-alquilo

La escisión del enlace éster por el O-alquilo, asistida por un cofactor Fe(II), crea un carbocatión intermedio que se estabiliza mediante la cadena de polieno conjugada. La deslocalización del carbocatión reduce el orden de enlace de la cadena de polieno, reduciendo así la energía de activación de la isomerización de trans a cis. Phe 103 y Thr 178 estabilizan adicionalmente el carbocatión isomerizado y se cree que son responsables de la estereoselectividad de la enzima. Después de la isomerización, un ataque nucleofílico por agua en C15 restaura la conjugación de la cadena de polieno y completa la escisión del enlace éster. [9] [13]

S alternativanorte2 mecanismo

Casi todas las demás reacciones bioquímicas de hidrólisis de ésteres ocurren a través de una reacción de adición-eliminación en el carbono acilo . Sin embargo, los estudios de marcaje isotópico han demostrado que el oxígeno en el producto final 11-cis-retinol de RPE65 se origina en el solvente en lugar del éster que reacciona, lo que respalda el mecanismo de escisión de O-alquilo. [13] Otro mecanismo posible comenzaría con un ataque nucleofílico en C11, pero dicho ataque dependería de algún nucleófilo , muy probablemente un residuo de cistina , para completar la parte de isomerización de la reacción. No solo es probable que el éster de polienilo no sea lo suficientemente pobre en electrones como para permitir esta reacción, sino que la región del sitio activo carece de residuos de cistina para actuar como nucleófilo. [8] [9]

Importancia clínica

Las mutaciones en este gen se han asociado con la amaurosis congénita de Leber tipo 2 (LCA2) y la retinitis pigmentosa (RP). [6] [18] Las mutaciones de RPE65 son las mutaciones detectadas con mayor frecuencia en pacientes con LCA en Dinamarca. [19] La gran mayoría de las mutaciones de RPE65 en pacientes con LCA2 y RP ocurren en el régimen de hélice beta y se cree que inhiben el plegamiento adecuado de proteínas y la unión del cofactor de hierro. Los sitios de mutación de hélice particularmente comunes son Tyr 368 e His 182. La sustitución en Arg 91 también es común y se ha demostrado que afecta las interacciones de la membrana de RPE65 y la captación del sustrato. [13]

Aunque la pérdida completa de la función se asocia con enfermedades como la LCA y la RP, se ha propuesto la inhibición parcial de RPE65 como tratamiento para la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE). Se ha demostrado que tanto la transretinilamina total (Ret-NH2) como el emixustat inhiben competitivamente el RPE65. [9] El emixustat se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase 3 de la FDA como terapia para la DMRE. [9] [20]

El trabajo de Jean Bennett y Katherine A. High con la mutación RPE65 ha revertido una forma hereditaria de ceguera. Recibieron la primera aprobación de la FDA de una terapia génica para una enfermedad genética, llamada Voretigene neparvovec . [ cita requerida ]

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

Estructura y función de las proteínas
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