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Articulo de referencia

Instrumento de PCR cuantitativa

Un termociclador de PCR en tiempo real de Applied Biosystems. Un termociclador de PCR cuantitativa , también llamado máquina de PCR en tiempo real , es un instrumento analítico ...

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Un termociclador de PCR en tiempo real de Applied Biosystems.

Un termociclador de PCR cuantitativa , también llamado máquina de PCR en tiempo real , es un instrumento analítico que amplifica y detecta ADN . Combina las funciones de un termociclador y un fluorímetro , lo que permite realizar la PCR cuantitativa . Los termocicladores de PCR cuantitativa detectan las señales fluorescentes producidas durante la amplificación del ADN, las cuales se correlacionan con la cantidad de ADN generado. Esto permite cuantificar con precisión el ADN específico presente en una muestra. Estos instrumentos se utilizan en numerosas aplicaciones, como el análisis de la expresión génica , la detección de variaciones genéticas , la genotipificación y el diagnóstico de patógenos bacterianos y virales.

La primera máquina de PCR cuantitativa se describió en 1993, [ 1 ] y dos modelos comerciales estuvieron disponibles en 1996. Para 2009, siete fabricantes diferentes ofrecían dieciocho modelos distintos. [ 2 ] Los precios oscilan entre aproximadamente 4500 y 150 000 USD. [ 3 ] [ 4 ] Muchas configuraciones de instrumentos de PCR en tiempo real estuvieron disponibles en el mercado, y los sistemas más utilizados están diseñados para admitir placas de 96 o 384 pocillos. Las principales dimensiones de rendimiento incluyen el control térmico, la detección de fluorescencia (fluorimetría) y el rendimiento de muestras.

Un instrumento de PCR cuantitativa suele estar equipado con software integrado para la adquisición y el análisis de datos en tiempo real , incluyendo cuantificación, análisis de curvas de fusión y métricas de control de calidad. La mayoría de los sistemas utilizan bloques térmicos basados ​​en Peltier .

Control térmico

Para que la PCR cuantitativa funcione de forma eficiente, se requiere un control térmico rápido y preciso.

Se han demostrado 30 ciclos de PCR en menos de 10 minutos. [ 5 ] El ciclado rápido ofrece varias ventajas, entre ellas, un menor tiempo de obtención de resultados, un mayor rendimiento del sistema y una mayor especificidad de la reacción. [ 6 ] Sin embargo, en la práctica, las compensaciones técnicas entre la facilidad de uso, la uniformidad de la temperatura y la velocidad implican que los tiempos de reacción suelen ser superiores a 25 minutos. [ 2 ]

La falta de uniformidad térmica durante el ciclo de temperatura contribuye a la variabilidad en la PCR [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] y, desafortunadamente, algunos termocicladores no cumplen con las especificaciones declaradas por los fabricantes. [ 10 ] Aumentar la velocidad del ciclo térmico generalmente reduce la uniformidad térmica y puede disminuir la precisión de la PCR cuantitativa . [ 11 ]

La uniformidad de la temperatura también tiene un efecto directo en la capacidad de discriminar diferentes productos de PCR mediante el análisis del punto de fusión. [ 12 ] Además de la uniformidad, la resolución con la que los instrumentos pueden controlar la temperatura es un factor que afecta su rendimiento al realizar análisis de fusión de alta resolución . [ 13 ]

Por lo tanto, la velocidad, la precisión y la uniformidad del control térmico son características de rendimiento importantes de los instrumentos de PCR cuantitativa.

Fluorimetría

Los instrumentos de PCR cuantitativa monitorizan el progreso de la PCR y la naturaleza de los productos amplificados mediante la medición de la fluorescencia .

La variedad de marcadores fluorescentes que se pueden monitorizar, la precisión con la que se pueden medir y la capacidad de discriminar las señales de diferentes marcadores son características de rendimiento relevantes.

Mediante el uso de un instrumento con suficientes canales ópticos y una optimización exhaustiva del ensayo, se pueden cuantificar simultáneamente hasta 7 dianas distintas en una sola reacción de PCR. [ 14 ] Sin embargo, incluso con una optimización exhaustiva, el rango dinámico efectivo de estos ensayos multiplex suele verse reducido debido a la interferencia entre las reacciones constituyentes. [ 15 ]

El ruido en las mediciones de fluorescencia afecta la precisión de la qPCR. Generalmente, depende de la variación en la intensidad de la fuente de excitación, el ruido del detector y el ruido mecánico. El análisis multifactorial sugiere que la contribución del ruido mecánico es el factor más importante y que los sistemas sin partes móviles en sus trayectorias ópticas probablemente proporcionen una mayor precisión cuantitativa. [ 9 ]

Además, al realizar análisis de fusión de alta resolución , un factor que afecta la sensibilidad de la detección de heterodúplex es la precisión fluorimétrica. [ 13 ]

Por lo tanto, el número de canales ópticos y el nivel de ruido en las mediciones de fluorescencia también son características de rendimiento importantes de los instrumentos de PCR cuantitativa .

Véase también

Referencias

  1. ↑ Higuchi, R.; Dollinger, G.; Walsh, PS; Griffith, R. (1992), "Amplificación y detección simultáneas de secuencias de ADN específicas", Bio/Technology , 10 (4): 413– 7, doi : 10.1038/nbt0492-413 , PMID 1368485 , S2CID 1684150  
  2. 1 2 Logan, J.; Edwards, K. (enero de 2009). «Capítulo 2: Una visión general de las plataformas de PCR». En Saunders, N. (ed.). PCR en tiempo real: tecnología y aplicaciones actuales . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.
  3. ↑ Ma, H.; Shieh, K.; Chen, G.; Chen, X.; Chuang, M. (2006), "Aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR)", The Journal of American Science , 2 (3): 1– 15
  4. ↑ Máquina de PCR en tiempo real de código abierto Open qPCR , archivada del original el 6 de abril de 2018 , recuperada el 15 de abril de 2018.
  5. ↑ Raghavan, V.; Whitney, S.; Ebmeier, R.; Padhye, N.; Nelson, M. Viljoen; Gogos, G. (2006), "Análisis térmico del termociclador basado en tubo de vórtice para la amplificación rápida de ADN: resultados experimentales y numéricos bidimensionales" , Review of Scientific Instruments , 77 (9): 094301–094301–9, Bibcode : 2006RScI...77i4301R , doi : 10.1063/1.2338283
  6. ↑ Wittwer, CT; Garling, DJ (1991), "Amplificación de ADN de ciclo rápido: optimización de tiempo y temperatura", BioTechniques , 10 (1): 76–83 , PMID 2003928 
  7. ↑ Kim, YH; Yang, I.; Bae, YS; Park, SR (2008), "Evaluación del rendimiento de termocicladores para PCR en condiciones de ciclado rápido", BioTechniques , 44 (4): 495–6 , doi : 10.2144/000112705 , PMID 18476814 
  8. ↑ Schoder, D.; Schmalwieser, A.; Schauberger, G.; Kuhn, M.; Hoorfar, J.; Wagner, M. (2003), "Características físicas de seis nuevos termocicladores", Clin. Chem. , 49 (6): 960– 3, doi : 10.1373/49.6.960 , PMID 12765996 
  9. 1 2 Lee, D. -S. (2010). "Modelado de un sistema de máquina de PCR en tiempo real y un enfoque sistemático para el diseño robusto de un sistema de PCR en tiempo real en un chip" . Sensors . 10 ( 1): 697– 718. Bibcode : 2010Senso..10..697L . doi : 10.3390/s100100697 . PMC 3270864. PMID 22315563 .  
  10. ↑ Schoder, D.; Schmalwieser, A.; Schauberger, G.; Hoorfar, J.; Kuhn, M.; Wagner, M. (2005), "Nuevo enfoque para evaluar el rendimiento de los termocicladores de PCR utilizados para pruebas de diagnóstico", J Clin Microbiol , 43 (6): 2724– 8, doi : 10.1128/jcm.43.6.2724-2728.2005 , PMC 1151936 , PMID 15956389  
  11. ↑ Hilscher, C.; Vahrson, W.; Dittmer, DP (2005), "Los protocolos de PCR cuantitativa en tiempo real más rápidos pueden perder sensibilidad y mostrar una mayor variabilidad", Nucleic Acids Res. , 33 (21): e182, doi : 10.1093/nar/gni181 , PMC 1297710 , PMID 16314296  
  12. ↑ Herrmann, M.; Durtschi, J.; Wittwer, C.; Voelkerding, K. (2007). "Comparación instrumental ampliada del análisis de fusión de ADN de amplicones para la detección de mutaciones y la genotipificación" . Química Clínica . 53 (8): 1544– 1548. doi : 10.1373/clinchem.2007.088120 . PMID 17556647 . 
  13. 1 2 Gundry, C.; Vandersteen, J.; Reed, G.; Pryor, R.; Chen, J.; Wittwer, C. (2003). "Análisis de fusión de amplicones con cebadores marcados: un método de tubo cerrado para diferenciar homocigotos y heterocigotos" . Clinical Chemistry . 49 (3): 396– 406. doi : 10.1373/49.3.396 . PMID 12600951 . 
  14. ↑ Köppel, R.; Zimmerli, F.; Breitenmoser, A. (2009), "PCR en tiempo real heptaplex para la identificación y cuantificación de ADN de carne de res, cerdo, pollo, pavo, caballo, oveja (cordero) y cabra", European Food Research and Technology , 230 : 125–33 , doi : 10.1007/s00217-009-1154-5 , S2CID 96340566 
  15. ↑ Bahrdt, C.; Krech, A.; Wurz, A.; Wulff, D. (2010). "Validación de un ensayo de PCR en tiempo real hexaplex recientemente desarrollado para la detección de la presencia de OMG en alimentos, piensos y semillas". Analytical and Bioanalytical Chemistry . 396 (6): 2103– 2112. doi : 10.1007/s00216-009-3380-x . PMID 20101506 . S2CID 22657985 .  
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